ＣＨＯ 세포에 대한 세포 뱅킹 전략을 최적화하기 위한 유동 세포측정 분석의 용도 document_id A220623052354

인간 치료용 생물약제 시장이 지난 10년간 매우 빠른 속도로 계속하여 성장하고 있다. CHO 세포주는 제조성, 안전성 및 조절성 측면에서 가장 매력적인 포유동물 발현 시스템 중의 하나이다. 일정한 품질의 치료 제품을 확보하기 위하여, 이들 세포주의 세포 뱅킹 시스템이 중요하다. CHO 세포의 마스터 세포 뱅크 (MCB), 제조용 세포 뱅크 (WCB) 및 제조후 세포 뱅크 (PPCB)의 창제가 CHO 세포주에서 생물약제에 대한 제조 공정의 개발에 필수 단계이다. 이들 뱅크의 품질이 중요한 이유는, 이들의 생성이 제품의 임상 개발뿐만 아니라, 궁극적으로 시장 공급 측면을 뒷받침하기 때문이다. 세포 뱅크 품질의 특성을 규정짓는 주요 매개변수는 해동 후 배양된 세포의 장기간의 생존이다. 또한, 장기간의 생존 외에, 건강함 및 안정성도 또한 적합한 세포 뱅크의 필수 특성이다. 바이알을 해동시킨 때로부터 건강한 성장, 유전적 안정성 및 높은 배양 생존력을 갖춘 접종 배양물을 확립하는데 소요되는 시간이 세포 뱅크의 품질을 평가하는데 중요하다. 최종적으로, 고품질의 세포 뱅크는 이들 모든 매개변수가 장기간의 뱅크 보관 기간 동안 안정하게 유지되도록 보장해야한다. 이들 특징은 모두 소정의 생산 세포주에 대한 동결보존 방법에 매우 의존적이다. 오늘날, CHO 세포가 사람 단백질을 정확하게 프로세싱하고 변형시킬 수 있기 때문에, 이들 CHO 세포로부터 제조되는 생물약제의 수가 증가하고 있다. CHO 세포를 이용하는 1 세대 제조 공정은 거의 필수적으로 배양 배지 중에 혈청이 존재할 것을 요구하였다. 안전성 및 조절성의 이점을 고려하여, 전 공정 동안 세포의 무혈청 배양을 가능케 하는 새로운 세포주 및 배양 방법을 개발하였다 (Merten, 1999). 그러나, 전체 제조 공정으로부터 혈청을 제거하는 것은 세포를 무혈청 동결 배지를 갖는 마스터 세포 뱅크 및 제조용 세포 뱅크에서 보관할 것을 요구한다. 혈청의 보호 효과를 적어도 부분적으로 대체할 수 있는 동결보호제를 사용함으로써 세포의 세포 뱅킹을 위한 다양한 전략이 기술되었다 (Groth et al., 1991). 그러나, 이러한 전략의 성공은 세포주, 배지 및 동결 및 해동의 프로토콜에 매우 의존적이다. 따라서, 상이한 동결보존 전략의 평가는 성공적인 공정 개발에 필수적이다. 현재, 새로이 제조된 세포 뱅크의 제1 평가는 한정된 수의 바이알을 해동시키고 세포를 5 내지 10 계대 동안 배양하는 방법으로 수행하였다. 트립판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 측정된 세포 수 및 생존력은 동결보존 후 세포의 회복을 기술하는데 통상적으로 사용되는 매개변수이다. 프로그램된 세포 사멸 또는 아폽토시스(apoptosis)는 성인에게서 적당한 배아 발생 및 조직 항상성에 중요한 과정이다. 프로그램된 세포 사멸은, 사멸 유도 시그널을 세포내 생화학적 과정으로 전환시켜, 궁극적으로 세포의 완전한 파괴를 유도하는 모든 다세포 생물체 내에 보존된 특정 소집단의 분자에 의해 조절된다 (Vaux and Korsmeyer 1999). 일단 촉발되면, 아폽토시스는 세포 유형에 따라 상이한 반응속도론(kinetics)으로 진행하여, 마침내 세포를 파괴하고 아폽토시스 소체(apoptotic body)를 형성한다. 아폽토시스의 결정적 단계는 사멸하는 세포가 표면 변화를 획득하고, 결국 식세포에 의한 이들 세포의 인식 및 섭취를 초래하는 것이다. 아폽토시스 세포의 표면 상에서의 상이한 변화, 예를 들어 트롬보스폰딘 결합 부위의 발현, 시알산 잔기의 상실, 및 포스파티딜세린 (PS)과 같은 인지질의 노출은 이전에 기술되었다. 인지질은 원형질막의 내부 및 외부 소편(leaflet) 사이에 비대칭적으로 분포하는데, 이때 포스파티딜콜린 및 스핀고미엘린은 지질 이중층의 외부 소편 상에 노출되고 포스파티딜세린은 시토졸과 접하는 내면 상에서 주로 관찰된다. 아폽토시스를 겪는 세포들은 이들의 원형질막의 인지질 비대칭을 깨뜨리고 막의 외층으로 전위된 PS를 노출한다. 이는 아폽토시스 세포 사멸의 초기 단계에 일어나며, 이 동안에 세포막은 온전하게 유지된다. 따라서, PS 노출은 사멸 세포의 초기의 광범위한 특질이다. 최근에 발견된 항응고제 특성을 갖는 단백질 계열인 안넥신에 속하는 안넥신 V는 아폽토시스 세포를 검출하는데 유용한 도구인 것으로 입증되었는데, 이는 안넥신 V가 Ca2+의 존재하에서 PS와 같은 음 전하의 인지질에 우선적으로 결합하고 포스파티딜콜린 및 스핀고미엘린에 대해 최소한으로 결합하기 때문이다. 세포막에 결합하는 안넥신 V를 측정하여 분석된 PS 비대칭의 변화는, 아폽토시스와 관련된 형태학적 변화가 일어나고 막 완전성이 상실되기 전에 검출되었다. FITC를 안넥신 V에 접합시킴으로써, 유동 세포측정에 의해 단일-세포 기준으로 아폽토시스 세포를 확인하고 정량하는 것이 가능하다 (Steensma et al., 2003). FITC-안넥신 V (녹색 형광) 및 실활(non-vital) 염료인 프로피듐 요오다이드 (적색 형광)로 세포를 동시에 염색함으로써, 온전한 세포 (FITC-PI-), 초기 아폽토시스 세포 (FITC+PI-) 및 후기 아폽토시스 또는 괴사 세포 (FITC+PI+)를 구별할 수 있다 (2가 분석). 발명의 개시 배경 부문에서 언급한 바와 같이, 동결보존된 세포 뱅크의 품질은 생물약제의 제조를 위해 세포 뱅크를 사용하는데 중요하다. 본 발명의 취지에서, 품질은, 동결보존된 세포 뱅크로부터 출발하여 증식 및 증대된, 세포의 해동후 활력(vitality), 건강함, 표현형/유전형 안정성 및 장기간의 보존 속성을 의미한다. 본 발명은, 프로그램된 세포 사멸, 특히 아폽토시스가 동결된 CHO 세포 뱅크의 동결보존된 CHO 세포의 해동 후 세포 사멸의 주원인이라는 놀라운 관찰을 토대로 한다. CHO 세포의 동결보존된 세포 뱅크로부터 증식 및 증대된 배양물 중의 세포들 중의 초기 아폽토시스의 증거가, 세포가 CHO 세포 뱅크로부터 출발하여 증식하고 증대된 때 관찰되는 해동후 활력, 건강함, 표현형/유전형 안정성 및 장기간의 보존 속성을 갖는 것을 의미하는 CHO 세포 뱅크의 품질과 상관관계가 있다는 것이 놀랍게도 입증되었다. 또한, 안넥신 V가 동결보존 후 해동된 CHO 세포에서 초기 아폽토시스를 검출하는데 적합한 마커라는 것이 입증되었다. 따라서, 본 발명은 CHO 세포의 동결보존된 세포 뱅크의 특성을 규명하는데 있어서의 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CHO 세포의 동결보존된 세포 뱅크, 바람직하게는 이러한 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동한 직후에 특성을 규명하는 방법에서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 방법은 a) 동결보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온처리하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 또한, a) 세포들을 세포 뱅크로서 액체 배지 중에 부분으로 나누어 동결보존하는 단계; b) 상기 세포 뱅크의 동결보존된 세포들의 일부를 해동시키는 단계; c) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 d) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 염색하여 상기 해동된 세포의 활력 비를 확립하는 단계를 포함하는 CHO 세포 뱅크의 품질을 결정하는 방법에서 안넥신 V의 용도에 관한 것이다. 액체 배지 중에 "부분으로 나누어 세포들을 동결보존함"은 각 0.25 내지 3×107 개의 세포들을 용기 내의 1 내지 2 ml의 액체 배지 중에 동결시키는 것을 의미한다. 세포 뱅크 당, 약 200개 용기 또는 바이알을 동결시킨다. 또한, 본 발명은, 해동 후 CHO 세포의 동결보존 세포 뱅크의 특성 규명을 위한 안넥신 V를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이며, 이때 안넥신 V는 해동 후 동결보존 세포의 활력 비를 결정하는데 사용된다. 본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 해동 후 동결보존 세포의 활력 비는, a) 동결보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온처리하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 측정될 수 있다. 추가로, 본 발명은 안넥신 V, 및 본원에 기재된 본 발명의 방법에 의해 CHO 세포의 세포 뱅크의 특성 규명에서 안넥신 V를 사용하기 위한 정보를 포함하는 포장 광고지를 포함하는 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은, a) 동결보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온처리하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하여, CHO 세포 뱅크의 특성을 규명하는 방법을 제공한다. 추가 태양에 따르면, 본 발명은 또한, a) 동결보존된 세포 뱅크의 세포들의 일부를 해동시키는 단계; b) 상기 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 세포를 안넥신 V와 함께 항온처리하는 단계; d) 안넥신 V에 결합하는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; e) 안넥신 V에 결합하지 않는 세포를 검출하고 그 수를 정량하는 단계; 및 f) 안넥신 V-결합 세포 대 안넥신 V-비-결합 세포의 비를 계산하는 단계를 포함하여, 해동 후 CHO 세포 뱅크의 활력 비를 측정하는 방법을 제공한다.