ＦＶＩＩＩ의 부위 지향 변형 document_id A220623052377

A형 혈우병은 5000명의 남성 당 1명의 추정 발생빈도를 갖는 가장 통상적인 유전 응고 장애이다. 이는 혈액 응고의 내인 경로의 중요한 성분인 FVIII의 결핍 또는 구조적 결함에 의해 유발된다. A형 혈우병에 대한 현재의 치료는 인간 FVIII의 정맥내 주사를 수반한다. 인간 FVIII는 대략 300 kD의 단일쇄 분자로서 재조합되어 생성되었다. 이는 A1-A2-B-A3-C1-C2의 구조적 도메인으로 이루어진다 (문헌 [Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp. 11-22]). 전구체 생성물은 골지체에서 200 kD(중) 및 80 kD(경)의 2가지 폴리펩티드쇄로 처리되며, 금속 이온으로 2가지 쇄를 결합시킨다(문헌 [Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352]; [Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979]). B-도메인 결실 FVIII (BDD, 90 kD A1-A2 중쇄 및 80 kD 경쇄) 또한 A형 혈우병에 대한 대체 요법으로서 효과적임을 나타냈기 때문에, FVIII의 B-도메인은 필수적이지 않은 것으로 보인다. B-도메인 결실 FVIII 서열은 B-도메인의 14 아미노산 대부분의 결실을 함유한다. A형 혈우병 환자는 현재 필요시 또는 일주일에 수차례 투여되는 예방적 요법으로서 FVIII의 정맥내 투여에 의해 치료된다. 예방적 요법을 위해, 일주일에 3차례 15 내지 25 IU/kg(체중)의 제VIII 인자가 주어진다. 환자에게는 일정하게 요구된다. 인간에서의 이의 짧은 반감기로 인하여, FVIII은 자주 투여되어야 한다. 전체 길이의 단백질에서의 300 kD보다 큰 이의 크기에도 불구하고, FVIII은 단지 약 11시간의 인간에서의 반감기를 갖는다(문헌 [Ewenstein et al, 2004, Semin. Hematol. 41, pp.1-16]). 빈번한 정맥내 주사의 필요는 환자의 순응도에 대한 중대한 장벽을 형성한다. 만일 FVIII 생성물이 더 긴 반감기를 가져서 덜 빈번한 투여를 필요로 하게 개발되었다면, 환자에게 보다 편할 수 있다. 게다가, 치료 비용도, 반감기가 증가되었다면, 더 적은 투여량이 필요할 수 있으므로, 감소될 수 있다. 현재의 요법에 대한 추가적인 단점은 약 25 내지 30%의 환자가 FVIII 활성을 억제하는 항체를 발달시키고 있다는 것이다(문헌 [Saenko et al, 2002, Haemophilia 8, pp. 1-11]). 억제 항체의 주된 에피토프는 잔기 484-508에서 A2 도메인, 잔기 1811-1818에서 A3 도메인 및 C2 도메인 내에 위치하고 있다. 항체의 발달은 대체 요법으로서의 FVIII을 사용하지 못하게 하며, 이러한 환자군으로 하여금 고복용량의 재조합 제VIIa 인자 및 면역 내성 요법을 사용하는 훨씬 더 고가의 치료를 찾게 한다. 이하의 연구는 억제 항체의 FVIII 에피토프를 식별하였다. 25개의 억제 혈장 샘플의 연구에서, 11개는 트롬빈 생성 73 kD 경쇄 분획 A3C1C2에 결합하고, 4개는 A2 도메인에, 10개는 양쪽 모두에 결합하는 것으로 발견되었다(문헌 [Fulcher, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp. 7728-32]). 또다른 연구에서, 환자로부터의 8개의 A2 도메인 억제제 중 6개가 재조합 A2 폴리펩티드에 의해 중화되었다(문헌 [Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), pp.1767-75]). 환자로부터의 9개의 억제제 중 6개에서의 에피토프가 A2 잔기 379-538에 맵핑되었다(문헌 [Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp. 6152-6]). 18개의 중쇄 억제제 중 한 에피토프가 A2 도메인의 동일한 N-말단 18.3 kD 영역에 국소화되었다(문헌 [Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), pp.1618-26]). 인간 A2 도메인 잔기 387-604를 동종 돼지 서열로 대체하여 생성된, 활성 재조합 하이브리드 인간/돼지 FVIII 분자는 인간 A2 억제제에 내성이 있고(문헌 [Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp. 8639-41]), A2에 결합하기 위한 환자의 A2 억제제와 경쟁하는 마우스 모노클로날 항체 mAB 413 IgG에 내성이 있다(문헌 [Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), pp.665-71]). 이 A2 도메인 에피토프는, 실험이 mAB 413 IgG 및 4개의 환자 억제제가 A2 도메인 잔기 484-508이 돼지의 것으로 대체된 하이브리드 인간/돼지 FVIII를 억제하지 못했을 때, A2 도메인 잔기 484-508에 추가로 국소화되었다(문헌 [Healey, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp.14505-9]). 또한, 이 하이브리드 FVIII는 스크리닝된 23의 환자 혈장 중 반 이상에 대하여 더 내성을 가졌다(문헌 [Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), pp. 564-8]). 돌연변이 유발을 스캐닝하는 알라닌은 시험된 5 모두의 환자 억제제에 결합하는데 중요한 잔기 487을 식별하였고, 잔기 484, 487, 489 및 492는 모두 mAB 413 IgG와의 상호작용에 모두 중요하였다(문헌 [Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp. 30191-5]). R484A/R489A/P492A 돌연변이주를 수용하지만 R484A/R489A 돌연변이주를 수용하지 않은 마우스에서의 억제 항체가는 대조 인간 BDD FVIII을 수용한 마우스에서보다 현저하게 낮았다(문헌 [Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), pp. 704-10]). 요약하면, A2 도메인의 484-508 영역이 FVIII 활성의 억제제를 위한 결합 부위로 여겨진다. FVIII에 대한 면역 반응의 발달 이외에, 통상의 요법의 또다른 문제는 생체내 FVIII의 짧은 반감기로 인하여 빈번한 투여가 필요하다는 것이다. 순환으로부터 FVIII의 제거 메카니즘이 연구되었다. 순환으로부터 FVIII 제거는, 폭넓은 리간드 특이성을 갖는 간의 제거 수용체인 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질(LRP)으로의 특이적인 결합에 부분적으로 기인한다(문헌 [Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl 4, pp. 133-139]). 최근, 저밀도 지단백질(LDL) 수용체 또한 FVIII의 혈장 수준을 조절하는데 LRP와 함께 작용하는 것과 같이 FVIII 제거에서 중요한 역할을 한다는 점이 드러났다(문헌 [Bovenschen et al., 2005, Blood 106, pp. 906-910]). 양쪽 모두의 상호작용은 세포 표면 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 결합하여 촉진된다. 마우스에서 혈장의 반감기는, LRP가 차단될 때 3.3배로, 또는 LRP 및 세포 표면 HSPG 모두가 차단될 때 5.5배로 연장될 수 있다(Sarafanov et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp. 11970-11979]). HSPG는 세포 표면 상의 FVIII를 농축시키고 이를 LRP로 전달하는 것으로 여겨진다. FVIII 상에서의 LRP 결합 부위는 A2 잔기 484-509(문헌 [Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 37685-37692]), A3 잔기 1811-1818(문헌 [Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp. 9370-9377]) 및 C2 도메인에서의 에피토프(문헌 [Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 23734- 23739])로 국소화되었다. 또한, FVIII는 단백질분해효소의 작용에 의해 순환으로부터 제거된다. 이 효과를 이해하기 위해서는 FVIII가 혈액 응고에 관여하는 메카니즘을 이해하여야 한다. FVIII는 vWF에 결합된 중쇄 및 경쇄의 헤테로다이머(heterodimer)로서 순환한다. VWF 결합은 FVIII 잔기 1649-1689(문헌 [Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp. 5230-5234]) 및 C1 도메인의 일부(문헌 [Jacquemin et al., 2000, Blood 96, pp. 958-965]) 및 C2 도메인의 일부(문헌 [Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp. 53691-8])와 관련된다. FVIII는 트롬빈에 의해 활성화되며, 이는 잔기 372, 740 및 1689 이후의 펩티드 결합을 절단하여 A1 , A2 및 A3-C1-C2 도메인의 헤테로트리머를 생성시킨다(문헌 [Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp. 12434-12439]). 활성화되었을 때, FVIII는 vWF로부터 해리되고, 인지질로의 결합에 의해 혈소판의 세포 표면에 농축된다. 인지질 결합은 FVIII 잔기 2199, 2200, 2251 및 2252와 관련된다(문헌 [Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp. 6374-6381]). 여기서 FVIII 잔기 558-565(문헌 [Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 20522-20527]) 및 1811-1818(문헌 [Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935- 1940])과의 상호작용을 통해 FIX에, 그리고 FVIII 잔기 349-372(문헌 [Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp. 15763-15771])와의 상호작용을 통해 FX에 결합하고, 내인 응고 경로의 필수 성분인 FX의 FIX 활성화에 대한 공동인자로서 작용한다. 활성화된 FVIII (FVIIIa)는 FVIII 잔기 336 및 562 이후의 절단을 통해 단백질분해효소 활성화 단백질 C(APC)에 의해 부분적으로 불활성화된다(문헌 [Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987]). 그러나, 불활성화의 주된 결정인자는 A1 및 A3-C1-C2로부터의 A2 도메인의 해리이다(문헌 [Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp. 8957-8962]). 단백질의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다고 증명된 한가지 방법은 PEG화이다. PEG화는 장쇄 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 단백질 또는 다른 분자로의 공유적인 부착이다. PEG는 선형 또는 분지형일 수 있어서 상이한 특징을 갖는 상이한 분자를 생성시킬 수 있다. 펩티드 또는 단백질의 반감기를 증가시키는 것 이외에, PEG화는 항체 발달을 감소시키고, 단백질분해효소의 소화로부터 단백질을 보호하고, 신장 여과물로부터 물질을 유지하는데 사용되었다(문헌 [Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51]). 또한, PEG화는 단백질의 전체적인 안정성 및 가용성을 증가시킬 수도 있다. 마지막으로, PEG화된 단백질의 지속적인 혈장 농도는 약물의 피크 수준으로 저점을 감소시켜서 초기 시점에서 단백질의 초생리학적인 수준을 도입할 필요를 제거하여, 유해한 부작용 정도를 감소시킬 수 있다. PEG 및 덱스트란과 같은 거대 중합체로 일차 아민(N-말단 및 라이신)을 표적화하는 것에 의한 FVIII의 랜덤 변형은 여러가지의 성공도로 시도되었다(WO 94/15625, US 특허 4970300, US 특허 6048720). 가장 극적인 향상은, 1994년 특허출원에서 공개되었고(WO 94/15625), 4배의 반감기 향상을 나타내지만, 전체 길이의 FVIII을 50배의 몰과량의 PEG와 반응시킨 후 2배의 활성 손실의 대가를 나타낸다. WO 2004/075923은 랜덤 변형을 통해 생성되는 FVIII 및 폴리에틸렌 글리콜의 컨쥬게이트를 개시한다. 랜덤하게 PEG화된 단백질, 예컨대 인터페론-알파(문헌 [Kozlowski et al, 2001, BioDrugs 15, pp. 419-429])는 과거에 치료제로서 허용되었다. 그러나, 이러한 랜덤 접근법은 헤테로다이머 FVIII에 대해서는 보다 더 문제가 있다. FVIII는 158개의 라이신, 2개의 N-말단, 및 다수의 히스티딘, 세린, 트레오닌 및 티로신을 비롯한 수백개의 잠재적인 PEG화 부위를 가지며, 이들 모두는 일차 아민을 우선적으로 표적으로 하는 시약으로 잠재적으로 PEG화될 수 있다. 예를 들어, PEG화된 인터페론 알파-2b에 대한 주된 위치 이성질체는 히스티딘임을 보였다(문헌 [Wang et al., 2000, Biochemistry 39, pp. 10634-10640]). 게다가, 전체 길이의 FVIII의 불균일 처리는 PEG화된 생성물에서의 더 심한 복잡함을 유발하는 출발 물질의 혼합물을 유발할 수 있다. FVIII 상에서의 PEG화 부위를 조절하지 않는 것에 대한 부가적인 단점은, PEG가 결정적인 활성 부위에서 또는 그 주위에 부착되어 있다면, 특히 하나 보다 많은 PEG 또는 단일의 거대 PEG가 FVIII에 컨쥬게이션되어 있다면, 잠재적인 활성 감소이다. 랜덤 PEG화가 다량의 다수의 PEG화된 생성물을 늘 생성할 수 있기 때문에, 단지 모노-PEG화된 생성물을 얻기 위한 정제는 극적으로 총 수율을 낮추게 할 수 있다. 마지막으로, 생성물 프로파일에서 막대한 불균일성은 각각의 무리의 일정한 합성 및 특징화를 거의 불가능하게 할 수 있다. 우수한 제조는 일정하고 잘 특징화된 생성물을 필요로 하기 때문에, 생성물 불균일성은 상업화에 대한 장벽이 된다. 이러한 모든 이유로, 보다 특이적인 FVIII의 PEG화 방법이 요구된다. 다양한 부위 지향 단백질 PEG화 전략은 최근의 리뷰에서 요약되었다(문헌 [Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005], 2005년 10월 15일 다이렉트 오브젝트 아이덴티파이어 (direct object identifier) doi:10.1016/j.cbpa.2005.10.007로 온라인으로 입수가능함). 한 접근법은 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의한 단백질로의 비천연 아미노산의 도입 후, 비천연 아미노산과 특이적으로 반응할 수 있는 PEG 유도체의 부가와 관련된다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 천연 단백질에서 발견되지 않는 케토기를 함유하는 것일 수 있다. 그러나, 단백질의 화학적 합성은 FVIII와 같이 거대한 단백질에 대해서는 실행가능하지 않다. 펩티드 합성의 현재의 한계는 약 50 잔기이다. 몇가지 펩티드가 결찰되어 더 큰 폴리펩티드 조각을 형성할 수 있지만, B-도메인 결실 FVIII를 생성하기 위해서는 20 결찰보다 더 많은 것이 필요할 것이며, 이는 이상적인 반응 조건 하에서도 1% 화복률 미만을 야기할 것이다. 비천연 아미노산을 사용한 단백질의 재조합 발현은 주로 비포유동물 발현계로 아직까지는 제한되어 있다. 이러한 접근법은 포유동물계에서 발현될 필요가 있는 FVIII와 같은 거대하고 복잡한 단백질에 대해서는 문제가 있는 것으로 예측된다. 단백질의 부위 특이적 PEG화에 대한 또다른 접근법은 N-말단 골격의 아민을 PEG-알데히드로 표적화하는 것이다. 그러나, 다른 아민기에 대한 특이성을 달성하기 위해 이 방법 하에서 요구되는 낮은 pH는 FVIII의 안정화에 필요한 좁은 거의 중성의 pH 범위와는 적합하지 않다(문헌 [Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, pp. 1-15]). 게다가, FVIII의 N-말단 PEG화는, 이 영역이 혈장 제거에 관련되지 않는다면, 증가된 혈장 반감기를 유도할 수 없을 것이다. 실제로, FVIII 경쇄의 N-말단 영역은, 순환에서 FVIII 생존에 결정적인 캐리어 단백질인 폰빌레브란드 인자(von Willebrand factor; vWF)에 결합하는데 관련되어 있다. 제VIII 인자의 N-말단 변형에 의해, 결정적으로 중요한 vWF와의 연관이 붕괴되거나 약해질 수 있다. 따라서, FVIII의 N-말단 PEG화는 FVIII의 혈장 반감기를 감소시키는 반대 효과를 가질 수 있다. WO 90/12874는 또다른 아미노산에 시스테인을 삽입하거나 또는 아미노산을 시스테인으로 치환한 후, 술프히드릴 반응기를 갖는 리간드를 부가하여 인간 IL-3, 과립구집락자극인자 및 적혈구생성인자 폴리펩티드의 부위 특이적 변형을 개시한다. 리간드는 시스테인 잔기에 선택적으로 결합한다. FVIII의 변형 또는 이의 임의의 변이체는 개시되어 있지 않다. 상기 언급한 이유로, 생체내에서 보다 긴 작용 기간 및 감소된 면역원성을 가지면서 관능 활성을 유지하는 향상된 FVIII 변이체에 대한 필요가 존재한다. 게다가, 이러한 단백질이 일정한 방식으로 균일한 생성물로서 생성되는 것이 바람직하다. 003c#발명의 요약003e# 본 발명의 목적은 향상된 약물동태학적 특성 및 치료 특성을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 관능성 FVIII 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 향상된 약물동태학적 특성을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 B 도메인 결실 FVIII 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질(LRP), 저밀도 지단백질(LDL) 수용체, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(HSPG) 및/또는 FVIII에 대한 억제 항체에 대한 감소된 결합을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 관능성 FVIII 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 생체내에서 보다 긴 작용 기간 및 감소된 면역원성을 가져서 일정한 방식으로 균일한 생성물로서 생성될 수 있는 향상된 FVIII 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리펩티드 상의 하나 이상의 소정의 부위에서 1종 이상의 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착된 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드를 포함하는 제VIII 인자 응고촉진 활성을 갖는 컨쥬게이트가 제공되며, 여기서 소정의 부위는 N-말단 아민이 아니다. 또한, 본 발명은, 소정의 부위에서 시스테인 잔기에 대한 코딩 서열로 치환하기 위해 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시키는 단계; 시스테인 강화 뮤테인을 생성하기 위해 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계; 뮤테인을 정제하는 단계; 컨쥬게이트가 형성되도록 실질적으로 도입된 시스테인 잔기에서만 폴리펩티드와 반응하도록 활성화된 생체적합성 중합체와 뮤테인을 반응시키는 단계; 및 컨쥬게이트를 정제하는 단계를 포함하는 이러한 컨쥬게이트의 제조 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 컨쥬게이트 및 제약적으로 허용가능한 보강제를 포함하는 제약 조성물 및 상기 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 치료 유효량만큼 투여하여 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, (a) 제VIII 인자 뮤테인의 노출 표면 상의 아미노산 잔기에 대한 시스테인 대체물을 갖는 부위 지향 제VIII 인자 뮤테인을 발현시키는 단계 (시스테인은 캡핑되어 있음); (b) 시스테인 뮤테인을 서서히 환원시키고 캡을 배출시키는 조건 하에서 시스테인 뮤테인을 환원제와 접촉시키는 단계; (c) 시스테인 뮤테인으로부터 캡 및 환원제를 제거하는 단계; 및 (d) 환원제의 제거로부터 약 5 분 이상 후에 PEG화 제VIII 인자 뮤테인이 생성되는 조건 하에서 술프히드릴 결합 잔기를 포함하는 PEG로 시스테인 뮤테인을 처리하는 단계를 포함하는 제VIII 인자 뮤테인의 부위 지향 PEG화 방법에 관한 것이다.