케라티노사이트 성장 인자의 치료학적 제형 document_id A220623052420

케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 는 상피세포에 특이적인 성장 인자이며 인간의 폐 배아 섬유아세포주의 조정 배지에서 처음으로 확인되었다 [Rubin 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806 (1989) 문헌을 참조하라]. KGF 에 대한 mRNA 의 발현은 다양한 발생 단계의 상피 조직으로부터 유도된 몇몇 간질(stromal) 섬유아세포주에서 검출되었다. KGF 의 전사는 또한 정상적인 성인의 신장 및 위장관 기관에서 추출된 RNA 에서 분명히 나타난다 [Finch 등의 Science 245:752-755 (1989) 문헌을 참조하라]. KGF 가 배양물에서 섬유아세포로부터 분비되고 표피가 아닌 진피에서 생체내 발현된다는 증거는 KGF 가 케라티노사이트 증식에 중요한 정상적인 파라크린 효과기(paracrine effector) 임을 나타내는 것이다. KGF 가 조직 배양에서 1 차 또는 2 차 인간 케라티노사이트의 증식을 자극하는데 있어서 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF) 만큼 효력이 있음이 연구에 의해 나타났다 [Marchese 등의 J. Cell. Phys. 144:326-332 (1990) 문헌을 참조하라]. KGF 는 표피, 경구 상피 및 하부 위장관 상피, 췌장, 간, 폐, 요로상피, 전립선 상피세포 및 그밖의 다른 것들을 함유하는 많은 기관들의 상피에 인접한 간엽 세포에 의해 생산된다 [Finch 등의 상기 문헌, Housley 등의 J Clin Invest. 94:1764-77, (1994) ; Yi 등의 Am J Path. 145:80-85, (1994) ; Pierce 등의 J Exp. Med. 179831-40, (1994) ; Yi 등의 J Urol. 154;1566-70,(1995) ; 및 Ulich 등의 J Clin Invest. 93:1298-1306 (1994) 문헌을 참조하라]. 정제된 KGF 의 부분적인 아미노산 서열분석 뿐만 아니라 인간 배아 섬유아세포주의 조정 배지로부터의 KGF 의 정제, KGF 유전자의 클로닝 및 생물학적으로 활성인 재조합 KGF 를 수득하기 위한 박테리아 세포에서의 유전자 발현이 국제 특허 공개 문헌 제 WO 90/08771 호에 기재되어 있다. 이러한 공개 문헌에는 또한 KGF 또는 KGF-유사 폴리펩티드가 이식된 각막 조직을 자극시키거나 또는 화상 상처에 적합한 상처 치료제로서 유용함이 기재되어 있다. 정상적인 성장한 동물에서의 생체외 및 생체내 연구로 KGF-1(이하 "KGF"라 명명함) 이 모낭 형태형성, 간세포 증식, 및 폐, 가슴, 췌장, 위, 소장 및 대장에서의 상피세포 증식에서 변화를 일으키는 것으로 밝혀졌다 [Panos 등의 J. Clin. Invest. 92:969-977 (1993) ; Ulich 등의 Am. J. Path. 144:862-868 (1994) ; Yi 등의 Am. J. Path. 145:80-85 (1994) ; 및 Ulich 등의 J. Clin. Invest. 93:1298-1306 (1994) 문헌을 참조하라]. 배아 또는 신생아 발생에 있어서 KGF 의 역할은 현재 연구 중에 있다 ; 그러나 갓 태어난 마우스에서 정낭 발생의 중요한 매개자인 것으로 상세히 기록되어 있다 [Alarid 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1074-1078, (1994) 문헌을 참조하라]. 또한, 간세포에서 KGF 를 과발현시킨 마우스에서 다낭포성 신장이 나타나는데 [Nguyen 등의 Oncogene 12:2109-19, (1996) 문헌을 참조하라], 계면활성제 촉진제를 사용하여 폐에서의 KGF 의 과발현으로 마우스에서 폐 낭선종이 나타나고 [Simonet 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12461-65, (1995) 문헌을 참조하라], 이는 정상적인 신장 및 폐 발생에 있어서 KGF 의 중요성을 나타내는 것이다. 재조합 KGF 를 토끼의 귀 또는 돼지 피부에서 유도된 외과적 상처에 국소적으로 사용할 경우에, KGF 가 재-상피형성을 증가시키고 상피세포의 두께를 증가시키는 것으로 나타나 있다 [Pierce 등의 J. Exp. Med. 179:831-840 (1994) ; 및 Staiano-Coico 등의 J. Exp. Med. 179:831-840 문헌을 참조하라]. Bosch 등의 [J. Clin. Invest. 98:2683-2687 (1996)] 문헌에는 케라티노사이트 성장 인자의 투여로 간세포 증식이 유도될 거라고 보고되어 있다. 일반적으로, 정제된 폴리펩티드는 수성 상태에서 단지 최저의 안정성을 나타내며 화학적 및 물리적 분해로 인해 처리과정과 저장기간 동안에 생물학적 활성도를 상실하게 된다. 또한, 수용액 형태의 폴리펩티드 조성물은 탈아미드화 반응(deamidation) 및 펩티드 결합 절단과 같은 가수분해 반응을 겪게 된다. 이러한 결과는 생물학적 활성도를 기본으로 한 규정된 투여량 범위 내에서 사람에게 투여하고자 하는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드에 심각한 문제를 나타낸다. 정제된 케라티노사이트 성장 인자의 투여로 인해 인구에 영향을 미치는 많은 질환들을 치료하기 위한 가망성 있는 후보물질을 유지하게 된다. 그러나, 다양한 저장 조건에서 정해진 시간 동안에 안정한 약학적 조성물을 유지하여 생체내에서 환자에게 효과적인 KGF 의 능력을 입증하지 못하였다. 따라서, 상피세포 성장의 KGF-매개 자극으로 이익을 얻은 다양한 질환을 치료하기 위한 치료제로서 유용한 안정한 제형 내에서 케라티노사이트 성장 인자를 제공하려는 노력이 본 분야에 필요하다. 발명의 요약 본 발명은 케라티노사이트 성장 인자(KGF) 를 동결건조시키기에 유용한 신규한 제형을 제공하여, 결과적으로 고도로 안정한 KGF 산물을 형성하는 것이다. 안정한 KGF 산물은 KGF 투여로 이익을 얻을 수 있는 장애 또는 증상을 앓고 있는 개체를 치료하는데 유용한 치료제이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 히스티딘, 증량제(bulking agent), 계면활성제 및 안정화 당(stabilizing sugar) 과 같은 당을 포함하는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, KGF 조성물은 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. KGF 단백질의 변이체는 대립형질 변이체, 또는 천연 KGF 의 단편, 키메라 또는 하이브리드 분자를 포함하여 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 KGF 는 천연 KGF 중 처음의 23 개의 아미노산이 결실된 △N23 KGF (SEQ ID NO : 3) 임을 생각할 수 있다. 변이체는 다음과 같이 본원에 기재되어 있는 분자들을 포함한다 : 예를 들어, 전하가 변경된 폴리펩티드로서, 여기에서 천연 KGF (SEQ ID NO : 2) 의 아미노산 잔기 41-154 중 하나 또는 그 이상이 결실되거나, 또는 감소된 양전하를 갖는 단백질에 영향을 미치도록 선별된 음하전된 잔기 또는 중성 잔기로 치환된다. 또다른 KGF 의 예로는 다음을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다 : 천연 KGF 의 Asn115 -His116 -Tyr117 -Asn118 -Thr119 의 루프-형성 영역(loop forming region) 내의 적어도 하나의 아미노산에 대한 고도의 루프-형성 잠재력을 갖는 적어도 하나의 아미노산을 치환시킴으로써 형성된 단백질. 또다른 예로는 천연 KGF 의 아미노산 123-133 (SEQ ID NO : 2 의 아미노산 154-164) 의 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나 또는 추가된 단백질을 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 증량제/삼투몰농도 조절제(osmolarity regulating agent) 의 사용을 생각할 수 있다. 증량제는 결정형(예를 들어, 글리신, 만니톨)이거나 또는 무정형(예를 들어, L-히스티딘, 수크로스, 덱스트란과 같은 중합체, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 및 락토스) 일 것이다. 하나의 실시형태에서, 증량제는 만니톨이다. 다른 실시형태에서, 만니톨은 약 2 ％ w/v 내지 약 5 ％ w/v 의 농도에서 혼입된다. 또다른 실시형태에서, 농도는 약 3 ％ w/v 내지 약 4.5 ％ w/v 이다. 다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 4 ％ w/v 이다. 다른 양상에서, 본 발명은 안정화 당(stabilizing sugar)을 포함하는조성물을 제공한다. 사용하고자 하는 당류로는 수크로스, 트레할로스 또는 글리신을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 당은 수크로스이다. 관련 실시형태에서, 수크로스의 농도는 약 1-3 ％ w/v 이다. 다른 실시형태에서, 수크로스의 농도는 2 ％ w/v 이다. 본 발명의 조성물의 pH 를 약 5.0 내지 약 8.0 의 범위로 조절하는 것을 생각할 수 있다. 하나의 실시형태에서, KGF 조성물의 pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.0 이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH 범위는 약 6.0 내지 약 7.0 이다. 또다른 실시형태에서, 조성물의 pH 는 약 6.5 이다. 또다른 양상에서, 본 발명의 조성물은 계면활성제의 사용을 생각할 수 있다. 사용된 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 를 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 이다. 관련 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.1 ％ w/v 내지 약 0.004 ％ w/v 의 범위 이내이다. 다른 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.01 ％ w/v 이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 10 mM 히스티딘, 4 ％ 만니톨, 2 ％ 수크로스, 및 0.01 ％(w/v) 폴리소르베이트 20 을 포함하는, pH 가 6.5 인 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 생각할 수 있다. 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 제조방법을 제공한다 : (a) 히스티딘, 증량제, 안정화 당(stabilizing sugar), 및 계면활성제로 이루어진 용액을 제조하는 단계 ; 및 (b) 상기 케라티노사이트 성장 인자(KGF) 를 동결건조시키는 단계. 관련 양상에서, 본 발명은 동결건조시키는 단계 전에 다음의 단계들을 추가로 포함하여 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 제조방법을 생각할 수 있다 : (b) 용액의 pH 를 약 6.0 내지 약 8.0 의 pH 로 조절하는 단계 ; (c) 케라티노사이트 성장 인자를 함유하는 용액을 제조하는 단계 ; (d) 단계 (b) 용액에서의 완충용액을 단계 (c) 용액의 완충용액으로 교체하는 단계 ; (e) 적절한 양의 계면활성제를 첨가하는 단계 ; 및 (f) 단계 (e) 로부터 혼합물을 동결건조시키는 단계. KGF 는 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 KGF 단백질이거나 또는 이의 변이체임을 또한 생각할 수 있다. 하나의 양상에서, 본 발명의 방법에서 증량제/삼투몰농도 조절제의 사용을 생각할 수 있으며, 여기에서, 증량제는 결정형(예를 들어, 글리신, 만니톨)이거나 또는 무정형(예를 들어, L-히스티딘, 수크로스, 덱스트란과 같은 중합체, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 및 락토스) 일 것이다. 하나의 실시형태에서, 증량제는 만니톨이다. 다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 약 2 ％ w/v 내지 약 5 ％ w/v 이다. 관련 실시형태에서, 만니톨의 농도는 약 3 ％ w/v 내지 약 4.5 ％ w/v 이다. 또다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 4 ％ w/v 이다. 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 당을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 당은 안정화 당(stabilizing sugar)이다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 당으로는 수크로스, 트레할로스 또는 글리신을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 당은 수크로스이다. 관련 실시형태에서, 수크로스의 농도는 약 1 ％ w/v 내지 약 3 ％ w/v 이다. 또다른 실시형태에서, 수크로스의 농도는 2 ％ w/v 이다. 본 발명의 방법에서 pH 를 생리학적 pH 로 조절하는 것을 생각할 수 있다. 하나의 실시형태에서, pH 범위를 약 5.0 내지 약 8.0 으로 조절한다. 다른 실시형태에서, pH 범위를 약 6.0 내지 약 8.0 으로 조절한다. 또다른 실시형태에서, pH 범위를 약 6.0 내지 약 7.0 으로 조절한다. 다른 실시형태에서, pH 를 pH 값 6.5 로 조절한다. 다른 양상에서, 본 발명의 방법에서 계면활성제의 사용을 생각할 수 있다. 사용된 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 이다. 관련 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 의 농도 범위가 약 0.1 ％ w/v 내지 약 0.004 ％ w/v 이내이다. 또다른 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.01 ％ w/v 이다. 하나의 양상에서, 본 발명은 10 mM 히스티딘, 4 ％ 만니톨, 2 ％ 수크로스, 및 0.01 ％ (w/v) 폴리소르베이트 20 을 포함하는, pH 가 약 6.5 인 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물의 유효량을 피실험자에게 투여하여 상피세포 성장의 KGF-매개 자극을 증가시킴으로써 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 치료하려는 질환은 다음과 같은 질환을 생각할 수 있다 : 장독소 ; 점막염 ; 화상 또는 그밖의 다른 부분층 피부 손상 및 전층 피부 손상 ; 모낭, 땀샘(한선) 및 기름샘(피지선)의 재증식 ; 부속기(adnexal) 구조의 증식 ; 수포성표피박리증 ; 화학요법으로 유도된 탈모증 ; 남성형 탈모증(male-pattern baldness) ; 위궤양 ; 십이지장궤양 ; 미란성위염, 식도염 또는 식도역류 ; 염증성 장질환 ; 하이알린막증(폐초자막증) ; 담배 연기 흡입으로 인한 손상(injuries from smoke inhalation) ; 폐기종 ; 간경변증, 간부전(liver failure), 급성 바이러스 간염, 그밖에 다른 독성으로 인한 간 손상 ; 또는 대숙주성이식편병(GVHD). 또한 본 발명은 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 가지고 있는 제 1 용기, 및 상기 동결건조시킨 조성물에 생리학적으로 수용가능한 재구성 용액(reconstitution solution)을 가지고 있는 제 2 용기를 포함하는 수성의 약학적 조성물을 제조하기 위한 키트를 제공한다. KGF 단백질은 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있거나, 또는 이의 변이체일 것이다. 생리학적으로 수용가능한 재구성 용액은 본원에 기재되어 있는 제제를 포함하여 임상적으로 유용한 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제와 항진균제, 등장성 제제(isotonic agent)와 흡수 지연제(absorption delaying agent) 등을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아닌 모든 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제일 것이다. 또한, KGF 조성물은 경구적, 국소적, 경피적, 비경구적, 흡입용 스프레이, 질내, 직장내, 또는 두개골내 주사를 포함하여 치료 의사가 적절하다고 생각하는 모든 경로에 의해 피실험자에게 투여될 것이다. 본원에서 사용된 비경구적 이란 용어는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유선내, 복강내, 척수강내, 구후(retrobulbar), 허파내 주사 및/또는 특정 부위에서의 외과적 이식에 의한 투여 또한 생각할 수 있다.