상보성 결정부위와 다른 분자의 부위에서 처리된 결합성을갖는 합성 면역글로불린 영역 document_id A220623052611

여기에서 기본적인 항체구조는 예로서 완전한 IgG1 면역글로불린을 사용해서 설명한다. 2개의 동일한 무거운(H) 사슬 및 2개의 동일한 가벼운(L) 사슬을 결합해서 Y형 항체분자를 형성한다. 무거운 사슬은 각각 4개의 영역을 갖는다. 아미노 말단의 가변영역(VH)은 Y의 끝에 있다. 이들은 Y'의 줄기를 토대로 3개의 불변 영역:CH1, CH2 및 카르복시 말단 CH3으로 이어진다. 짧은 스트레치, 스위치는 무거운 사슬 가변 영역과 불변 영역을 연결한다. 힌지(hinge)는 CH2와 CH3(Fc프라그먼트)를 항체의 나머지(Fab프라그먼트)에 연결한다. 하나의 Fc와 2개의 동일한 Fab프라그먼트는 완전한 항체 분자에 있어서 힌지의 단백질 가수분해 분할에 의해 생성될 수 있다. 가벼운 사슬은 2개의 영역, 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)으로 이루어지고, 스위치로 분리된다. 힌지부위에 디술피드 결합은 2개의 무거운 사슬을 연결한다. 가벼운 사슬은 부가적인 디술피드 결합에 의해 무거운 사슬에 결합된다. Asn 연결 탄수화물 부분은 면역글로불린의 급에 따라 불변 영역에서의 다른 위치에 부착된다. IgG1에 대해 힌지부위에 Cys235와 Cys238 쌍사이에 2개의 디술피드 결합은 2개의 무거운 사슬에 결합한다. 가벼운 사슬은 CH1 영역에 Cys229와 CL영역에 Cys214 사이에 2개의 부가적인 디술피드 결합에 의해 무거운 사슬에 결합된다. 탄수화물 부분은 각 CH2의 Asn306에 부착하고, Y줄기에 벌지(bulge)라고 하는 것을 생성한다. 이들 특성은 충분한 기능적인 결과를 갖는다. 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 가변 영역 (VH)와 (VL)은 항원과 반응하는 위치인 Y의 "끝"에 있다. 이 분자의 끝은 아미노산 서열의 N-말단이 위치된 측에 있다. Y의 줄기는 보체의 활성화 및 Fc 수용체와 상호작용과 같은 작동체 기능, 또는 ADCC 및 ADCP을 효율적으로 조정하기 위한 방법으로 추정된다. CH2와 CH3 영역은 작동체 단백질과 상호작용을 용이하게 하는 것으로 생각된다. 아미노산 서열의 C-말단은 그 끝쪽의 반대측에 위치되고, 그 Y의 "바닥"이라고 칭할 수 있다. 완전한 IgG1의 구조는 도1a에 설명된다. 람다(λ) 및 카파(κ)라고 하는 2개의 형태의 가벼운 사슬은 항체에서 발견된다. 주어진 면역글로불린 중 하나는 λ사슬 또는 κ사슬이고, 각각인 것은 아니다. λ 또는 κ 가벼운 사슬을 갖는 항체 사이에 기능적인 차이는 발견되지 않는다. 주요한 인간 면역글로불린류 모노머의 구조적 조직은 도1b에 표시된다. 부류는 그 각각의 무거운 사슬의 서열 및 조성이 다르다. IgM 및 IgE는 힌지 영역이 부족하지만 각각은 추가의 무거운 사슬영역(CH4)를 함유한다. 그 사슬을 연결한 디술피드 결합(라인)의 수 및 위치는 아이소타입 사이에 차이가 있다. 이들은 N-연결 탄수화물기의 분포도 다르고, 기호로는 원으로 표시된다. 항체분자의 각 영역은 압축된 역평행 베타 배럴로 서로 대향해서 단단히 채워진 2개의 베타 시트의 유사한 구조를 갖는다. 이 유지된 구조는 면역글로불린 접힘이라고 한다. 불변 영역의 면역글로불린 접힘은 4-가닥 시트(4-stranded sheet)에 대향해서 채워진 3-가닥 시트(3-stranded sheet)를 함유한다. 이 접힘은 각 시트의 베타 가닥 사이의 수소결합, 내부의 대향 시트의 잔기 사이의 소수성 결합, 및 시트 사이의 디술피드 결합에 의해 안정화된다. 3가닥 시트는 C, F 및 G 가닥으로 이루어지고, 4가닥 시트는 A, B, E 및 D 가닥을 갖는다. 문자 A부터 G는 면역글로불린 접힘의 아미노산 서열에 따라서 베타 가닥의 서열위치를 나타낸다. 가변 영역의 접힘은 4가닥 및 5가닥의 2개의 시트로 배열된 9개의 베타 가닥을 갖는다. 5가닥 시트는 불변 영역의 3가닥 시트와 구조적으로 동족이고, 추가의 가닥 C' 및 C"을 함유한다. 나머지 가닥(A, B, C, D, E, F, G)은 불변 영역의 면역글로불린 접힘에 있어서 대응하는 것으로서 동일한 위상 및 유사한 구조를 갖는다. 디술피드 결합은 불변 영역에서와 같이 대향 시트인 가닥 B와 F를 연결한다. 도2에서 면역글로불린 접힘이 면역글로불린의 불변 영역 및 가변 영역에 대해서 도시된다. 가벼운 및 무거운 면역글로불린 사슬의 가변 영역은 3개의 초가변루프, 또는 상보적 결정 부위(CDRs)를 함유한다. V영역의 3개의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3)은 베타 배럴의 하나의 끝에 밀집한다. CDR은 면역글로불린 접힘의 베타 가닥 B-C, C'-C", 및 F-G을 연결하는 루프이다. CDR의 잔기는 하나의 면역글로불린 분자 마다 다르고, 각 항체에 항원특이성을 부여한다. 항체분자의 끝에 VL 및 VH 영역은 6개의 CDR(각 영역에 3개)이 항원의 특이성 결합에 대한 표면(또는 구멍)을 만드는데 협동하도록 밀접하게 채워진다. 항체의 자연 항원 결합자리는 가벼운 사슬 가변영역의 B-C, C'-C", 및 F-G 가닥과, 무거운 사슬 가변영역의 B-C, C'-C", 및 F-G 가닥을 연결하는 루프로 이루어진다. 설계로서 단백질의 3D 구조를 사용해서, 많은 단백질의 표면상에 위치한 아미노산 잔기를 단백질의 중심구조를 스캐폴드로서 사용하여 랜덤화한다. 이러한 방법의 예는 참조로 여기에 포함된 하기 참조문헌에 기재되거나 검토되어 있다:Nygren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22: 575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6,562,617. 이 방법의 기본적인 원리는 많은 단백질이 루프, 턴, 랜덤 코일 등의 구조에 의해 서로 연결되는 베타 시트 또는 알파 헬리스 등의 2차 구조 요소의 특정 배열에 의해 형성된 안정한 코어를 갖는다는 관찰을 토대로 한다. 일반적으로 이들 후자의 3개의 구조 요소는 단백질의 전체의 구조에 비해 덜 중요하고, 이들 구조 요소의 아미노산 잔기는 빈번히 단백질의 일반적인 접힘을 파괴하지 않은채로 교환될 수 있다. 이 설계 원리에 대해 자연적으로 발생하는 예는 항체의 CDR이다. 인공적인 예(artificial example)는 리포칼린, 앤키린 및 다른 단백질 스캐폴드를 들 수 있다. 자연 면역글로불린에서 CDR 루프가 아닌 루프는 항원 결합 또는 에피토프 결합 특이성을 갖지 않지만, 전체의 면역글로불린 분자 및/또는 그 작동체(effector)의 정확한 접힘 또는 다른 기능에 기여하므로 본 발명이 목적으로 하는 구조적 루프로 불린다. 미국특허 제6,294,654호에 있어서, 힌지 부위와 가변부위 사이의 CH1 영역의 항체(Ab)의 비-CDR 루프에 펩티드 항원이 포함될 수 있는 개질된 항체가 만들어지고, 얻어진 Ab는 펩티드 항원이 MHC II 내의 APC의 표면상에 제시되어 면역 반응을 제공하도록 APC에 취해질 수 있다는 것이 개시되어 있다. 이들 삽입된 펩티드가 에피토프이고 캐리어 분자의 전체구조는 중요하지 않다. 라스(ras) 펩티드는 면역글로불린의 (비-CDR)루프에 위치될 수 있고, 면역글로불린은 여전히 분비될 수 있다는 것이 입증되어 있다. 면역글로불린이 적절하게 접히지 않으면 면역글로불린이 분비되는 것을 방해하는 세포에는 엄격한 "품질관리"가 존재하며, 그 루프의 아미노산 서열을 변경하는 것은 세포가 부정확하다고 감지하는 구조로 단백질을 접히게 해서 열화시킬 수 있다. 따라서 상술한 예 이외에, 면역글로불린의 상태를 변화시키지 않고 구조적인 루프를 더 변경하는 것은 곤란하다. 미국 특허 출원 2004/0101905호에는 목적 결합위치 및 Fc 작동체 펩티드를 포함하는 결합분자가 기재되어 있다. Fc 작동체 펩티드는 작동체 분자(effector molecule)와 상호작용하는 펩티드이다. 면역글로불린 프라그먼트의 CH1-영역의 비-CDR루프안으로의 작동체 펩티드의 삽입이 나타나 있다. Fc 작동체 펩티드는 항체의 비-CDR 루프에서 자연스럽게 발생되는 구조이어서, 면역글로불린에 다른 등가의 위치상에 그래프트 된다면 면역글로불린의 구조를 방해하지 않는다고 기대된다. 이 개시된 것에 따른 비-CDR 루프에 그래프트된 모든 펩티드는 다른 구조적 환경에 의해 비활성화될 가능성이 높음에도 불구하고, 선택되고 있다. 기능과 분비가 중요하기 때문에 면역글로불린의 접힘구조를 방해하지 않는 것이 중요하므로, 그 구조 및 기능을 보유해야만 하는 루프에 펩티드를 삽입하는 것은 곤란하다는 것이 상기 기재된 종래의 문헌에 기재되어 있다. 미국특허 출원 2004/0132101 및 2005/0244403에는 작동체 리간드에 결합 친화도를 변경하고, 항체의 구조적 루프에 대한 자연 리간드인 돌연변이 면역글로불린이 기재되어 있다. 이 실시형태에서, 전체의 면역글로불린 분자에 걸쳐서 각종 영역에 많은 돌연변이체는 전체의 항체의 작동체 기능에 영향을 미치는 것이 기재되어 있다. 다른 종래의 문헌에서는 기존의 항원 결합자리를 조작하여, 신규한 결합특성을 도입하기 위해 면역글로불린 유사 스캐폴드를 지금까지 사용해 왔다. 그러나, 지금까지 CDR 부위만이 항원 결합을 위해 처리되고, 즉 면역글로불린 접힘(fold)의 경우, 자연 항원 결합자리만을 결합 친화성 또는 특이성을 변화시키기 위해 변경해 왔다. 이러한 조작된 면역글로불린의 여러 상이한 포맷이 기재된 많은 공지문헌이 존재하며, 단일 사슬 Fv프라그먼트(ScFv) 또는 Fab프라그먼트의 형태로 파지 입자의 표면상에 나타내거나 또는 각종 원핵생물 또는 진핵생물 발현계에 가용적으로 발현된다. 이 분야에서 대표저자중에는 Greg Winter, Andreas Pluckthun 및 Hennie Hoogenboom이 있다.