높은 건조물 (ＤＭ) 함량을 갖는 바이오매스의 효소적가수분해 document_id A220623052618

무수한 산업적 및 농업적 공정, 예를 들어 도시 작업, 식품 및 사료 가공 및 조림 (forestry)은 바이오매스, 폐기물 및 중합체성 당 함유 부산물 (예를 들어, 전분, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 형태임)을 발생시킨다. 농업 및 화학 산업, 및 공공 단체들은 그러한 바이오매스를 보다 높은 가치의 물질로 전환시키기 위한 공정을 개발하는데 상당한 관심을 갖고 있다. 따라서, 예를 들어 그러한 바이오매스는 미생물 및/또는 가수분해 효소를 사용하여 바이오-에탄올, 바이오가스 (biogas) 또는 화학 물질로 잠재적으로 전환될 수 있다. 그러나, 현재 공지된 대부분의 공정은 그들의 높은 제조 비용 및 높은 에너지 요구량 및 이에 따른 본질적으로 불확실한 경제적 실행 가능성때문에 대규모의 상업적 실시에 아직 도달하지 못하였다. 식품 및 사료로서 중요한 것 이외에도, 바이오매스로부터의 탄수화물은 수많은 산업적 공정을 위한 공급원료로서 사용될 수 있다. 중합체 형태의 잘 알려진 제품은 셀룰로스가 주요 성분인 종이이다. 그러나, 올리고머 및 단량체로 가공되는 경우, 탄수화물은 수많은 산업적 공정을 위한 중요한 공급원료이다. 상세하게 기재될 바와 같이, 그들은 수많은 미생물적 공정에 필수적일 뿐 아니라, 예를 들어 식품 및 사료용 특수 탄수화물 (예를 들어, 트레할로스 (trehalose))로의 효소적 가공을 위한 공급원료로서 사용될 수 있다. 또한, 탄수화물 올리고머 및 단량체는 플라스틱 및 유기 화학 물질로의 가공을 위해 석유 화학 물질을 대체할 수 있다. 또한, 탄수화물은 촉매적 수소화에서 수소 담체로서 사용될 수 있다. 이에 따라, 저-비용 및 풍부한 자원의 가공된 탄수화물이 산업적 가공을 위해 이용가능하게 될 수 있는 경우, 그것은 상당한 경제적 잠재력을 가질 것이 명백하다. 전분은 식물에 있어서 가장 보편적인 저장 탄수화물이고, 종별로 물리적 특성 및 크기가 뚜렷하게 다른 과립의 형태로 존재한다. 전분 과립은 일반적으로 동일한 분자내의 수소 결합 및 여타 이웃 분자와의 수소 결합 형성으로 인해 물 및 가수분해 효소에 의한 침투에 상당한 저항성이 있다. 그러나, 이들 분자내- 및 분자간-수소 결합은 현탁액의 온도가 올라가면 약해질 수 있다. 전분의 수성 현탁액이 가열되는 경우, 수소 결합은 약해지고, 물은 흡수되며, 전분 과립은 팽창된다. 이러한 과정은 통상적으로 젤라틴화로 불려지는데, 이는 형성된 용액이 높은 점성의 젤라틴성 점조성 (consistency)을 갖기 때문이다. 화학적으로, 전분은 글루코스의 천연 중합체이고, 일반적으로 실온에서 물 중에 불용성이지만 분산성이 있고, 셀룰로스와 유사한 반복 단위로 구성되어 있고, 셀룰로스가 β-1,4 글루코시드 결합으로 서로 연결된 것과는 반대로, α-1,4 및 α-1,6 글루코시드 결합으로 서로 연결되어 있다. 상기 단위는 아밀로스로 불려지는 직쇄 성분, 또는 아밀로펙틴으로 불려지는 분지쇄 성분을 형성한다. 대부분의 식물 종자, 곡류 및 덩이줄기는 약 20 내지 25％의 아밀로스를 함유한다. 그러나 어떤 것, 예를 들어 완두 전분은 60％의 아밀로스를 갖고, 옥수수의 특정 종은 80％의 아밀로스를 갖는다. 왁스성 곡류 종류, 예컨대 쌀은 낮은 아밀로스 함량을 갖는다. 전분과는 별개로, 식물 바이오매스에 있어서 3가지 주요 구성요소는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌이다 (이들은 통상적으로 포괄적 용어인 리그노셀룰로스로 지칭됨). 포괄적 용어로서의 폴리사카라이드 함유 바이오매스에는 전분 및 리그노셀룰로스성 바이오매스가 포함된다. 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌은 상이한 식물 및 각 식물의 상이한 부분에 다양한 양으로 존재하고, 그들은 식물의 구조적 골격을 형성하기 위해 친밀하게 회합되어 있다. 셀룰로스는 전적으로 β-1,4-글루코시드 결합에 의해 서로 연결된 D-글루코스로 구성되고 10,000 이하의 중합도를 갖는 호모폴리사카라이드이다. 셀룰로스의 선형 구조는 분자내- 및 분자간-수소 결합의 형성을 가능하게 하고, 이것으로 인해 셀룰로스 쇄가 미세원섬유 (micro fibril)로 응집된다. 정렬도가 높은 미세원섬유내 부위는 결정질이라고 하고, 정렬도가 낮은 부위는 무정형이라고 한다. 미세원섬유는 원섬유로 어셈블링되며, 원섬유가 이후에 셀룰로스 섬유를 형성한다. 미세원섬유성 배열과 함께 셀룰로스의 부분적인 결정질 구조는 셀룰로스에 높은 인장강도를 부여하고, 그것은 셀룰로스가 대부분의 용매에 불용성이도록 만들고, 미생물에 의한 분해, 즉 효소적 가수분해에 대한 셀룰로스의 저항성에 부분적으로 관여한다. 헤미셀룰로스는 D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, D-크실로스, L-아라비노스, D-글루쿠론산 및 4-O-메틸-D-글루쿠론산과 같은 수많은 단량체 잔기로 구성된 복잡한 불균질 폴리사카라이드이다. 헤미셀룰로스는 200 미만의 중합도를 갖고, 측쇄를 가지며, 아세틸화될 수 있다. 전나무, 소나무 및 가문비나무 (spruce)와 같은 연목에서는 갈락토글루코만난 및 아라비노-4-O-메틸-글루쿠로녹실란이 주요 헤미셀룰로스 분획물이다. 자작나무, 포플러나무, 사시나무 또는 오크나무 (oak)와 같은 경목에서는 4-O-아세틸-4-메틸-글루쿠로녹실란 및 글루코만난이 헤미셀룰로스의 주요 구성요소이다. 벼, 밀, 귀리 및 스위치 그래스 (switch grass)와 같은 벼과 식물은 주로 글루쿠로노아라비녹실란으로 구성된 헤미셀룰로스를 갖는다. 리그닌은 페닐 프로판 단위의 중합에 의해 형성된 복합 망상체이고, 그것은 리그노셀룰로스에서의 가장 풍부한 비-폴리사카라이드 분획물을 구성한다. 리그닌에서의 3가지 단량체는 p-쿠마릴 알콜, 코니페릴 알콜 및 시나필 알콜이고, 그들은 아릴글리세릴-β-아릴 에테르 결합을 통하여 가장 빈번하게 결합한다. 리그닌은 헤미셀룰로스와 결합하여 이를 둘러싸서, 미생물적 및 화학적 분해에 대한 보호를 제공한다. 상기에 명시된 바와 같이, 가공된 바이오매스는 미생물 및/또는 가수분해 효소를 사용하여 화학 물질 또는 바이오-에탄올로 잠재적으로 전환될 수 있거나, 또는 가공된 바이오매스로부터의 탄수화물은 수많은 산업적 공정 (예를 들어, 식품 및 사료를 위한 특수 탄수화물로의 효소적 가공)을 위한 공급원료, 또는 플라스틱 및 유기 화학 물질의 제조에 있어서의 석유 화학 물질의 대체품으로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오매스에서의 탄수화물의 가공은 비-탄수화물 성분의 분리 및 분별과 병행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 바이오-에탄올 제조 방법의 통합된 부분으로 이용하는 것이 특히 바람직하다. 폴리사카라이드 함유 바이오매스로부터의 바이오-에탄올 제조는, 1) 전처리, 2) 폴리사카라이드의 발효가능한 탄수화물로의 가수분해, 및 3) 탄수화물의 발효의 3단계로 나누어질 수 있다. 전처리는 폴리사카라이드의 후속적인 가수분해 (예를 들어, 효소적 가수분해)가 식물 물질의 다른 보호 구조 (예를 들어, 리그닌)의 파괴를 요구하는 경우에 필요하다. 여러 전처리 기술이 공지되어있다. 곡물 및 곡류에 대하여, 이러한 전처리는 표면을 접근가능하게 하기 위한 간단한 건식 제분의 형태일 수 있으나, 리그노셀룰로스성 바이오매스에 대하여는, 열적 및/또는 화학적 과정 또한 요구된다. 예를 들어, 정제 전분으로 구성된 폴리사카라이드 함유 바이오매스는 효소적 가공 전에 상기 전처리 방법을 요구하지 않는다. 전처리-공정은 산성 가수분해, 증기 폭발 (steam explosion), 산화, 알칼리 또는 에탄올 등으로의 추출을 기반으로 할 수 있다. 전처리 기술의 통상적인 특징은, 가능한 첨가된 반응물의 작용과 함께 100℃ 초과의 온도에서 발생하는 식물 물질의 연화 및 이완을 이용한다는 것이다. 전처리 이후에, 바이오-에탄올 또는 여타 생화학 물질의 제조를 위한 폴리사카라이드 함유 바이오매스의 이용에서의 다음 단계는 분리된 전분, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스를 발효가능한 당으로 가수분해시키는 것이다. 효소적으로 수행되었을 경우, 이것은 상이한 작용 방식을 갖는 수많은 상이한 효소를 요구한다. 이 효소는 외부에서 첨가될 수 있거나, 또는 바이오매스 상에서 증식하는 미생물이 그러한 효소를 제공할 수 있다. 셀룰로스는 탄수화물 분해성 셀룰라제에 의해 글루코스로 가수분해된다. 셀룰로스 분해성 시스템 (cellulolytic system)에 대한 유력한 견해에 따르면, 셀룰라제를 하기의 세 부류로 나눈다. 엑소-1,4-β-D-글루카나제 또는 셀로비오히드롤라제 (CBH) (EC 3.2.1.91) (셀로비오스 단위를 셀룰로스 쇄의 말단으로부터 절단함); 엔도-1,4-β-D-글루카나제 (EG) (EC 3.2.1.4) (셀룰로스 쇄에서 무작위적으로 내부 β-1,4-글루코시드 결합을 가수분해함); 1,4-β-D-글루코시다제 (EC 3.2.1.21) (셀로비오스를 글루코스로 가수분해하고, 또한 셀로올리고사카라이드로부터 글루코스 단위를 절단함). 헤미셀룰로스에서의 상이한 당은 헤미셀룰라제에 의해 분리된다. 헤미셀룰로스 분해성 시스템은 헤미셀룰로스의 이종성 (heterologous nature) 때문에 셀룰로스 분해성 시스템보다 더 복잡하다. 상기 시스템은 특히, 엔도-1,4-β-D-크실라나제 (EC 3.2.1.8) (크실란 쇄에서의 내부 결합을 가수분해함); 1,4-β-D-크실로시다제 (EC 3.2.1.37) (비-환원 말단으로부터 크실로올리고사카라이드를 공격하여 크실로스를 분리함); 엔도-1,4-β-D-만나나제 (EC 3.2.1.78), (내부 결합을 절단함); 1,4-β-D-만노시다제 (EC 3.2.1.25) (만노올리고사카라이드를 만노스로 절단함)를 포함한다. 측기는 α-D-갈락토시다제 (EC 3.2.1.22), α-L-아라비노푸라노시다제 (EC 3.2.1.55), α-D-글루쿠로니다제 (EC 3.2.1.139), 신나모일 에스테라제 (EC 3.1.1.-), 아세틸 크실란 에스테라제 (EC 3.1.1.6) 및 페룰로일 에스테라제 (EC 3.1.1.73)와 같은 수많은 효소에 의해 제거된다. 전분 가수분해에서의 사용을 위한 가장 중요한 효소는 알파-아밀라제 (1,4-α-D-글루칸 글루카노히드롤라제) (EC 3.2.1.1)이다. 이들은 1,4-α-D-글루코시드 결합을 절단하는 엔도-작용 히드롤라제이고, 1,6-알파-D-글루코시드 분기점을 우회할 수 있으나, 가수분해할 수는 없다. 그러나, 엑소-작용 글리코아밀라제, 예컨대 베타-아밀라제 (EC 3.2.1.2) 및 풀룰라나제는 (EC 3.2.1.41) 또한 전분 가수분해에 사용될 수 있다. 전분 가수분해의 결과는 1차적으로 글루코스, 말토스, 말토트리오스, α-덱스트린, 및 다양한 양의 올리고사카라이드이다. 전분계 가수분해물이 발효에 사용되는 경우, 단백질분해 효소를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 그러한 효소는 미생물의 응집 (flocculation)을 방지할 수 있고, 미생물이 이용가능한 아미노산을 생성할 수 있다. 리그노셀룰로스성 바이오매스의 전처리 및 효소적 가수분해와 함께, 산화 효소의 사용이 전체 가수분해, 및 예를 들어 후속적인 발효에 이용되는 미생물의 생존률에 대해 긍정적인 효과를 가질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 효과에 대한 근거는 산화 효소에 의해 유발되는 리그닌과 여타 페놀계 억제제의 산화적 가교이다. 통상적으로, 락카제 (EC 1.10.3.2) 또는 퍼옥시다제 (EC 1.11.1.7)는 외부에서 첨가하여 이용되거나, 또는 적용된 미생물에 락카제 유전자를 도입시킴으로써 이용된다. 바이오매스의 효소적 가수분해는 이전에 기재되었다. 그러나, 리그노셀룰로스성 바이오매스의 경우에는, 1 인치 (25.4 mm) 미만의 평균 크기를 갖는 입자 및 섬유로 구성되고, 또한 상대적으로 낮은 건조물 함량, 즉 20％ (w/w) 미만의 건조물 함량을 갖는 물질만이 그러한 방법에 의해 성공적으로 가수분해되었다. US4409329에는 고체 셀룰로스 물질의 당으로의 가수분해가 기재되어 있고, 여기에서는 30 내지 80％ (w/w)의 셀룰로스를 함유하는 3 내지 20％의 (w/w) 고체 사료의 과립성 슬러리를 셀룰라제 효소 복합체로 처리함으로써, 셀룰로스를 간단한 당으로 가수분해시킨다. 고체 셀룰로스-함유 투입 원료는 직경 0.01 내지 1 인치 (0.0254 내지 25.4 mm)의 평균 입자 크기를 갖는다. 천공 날개가 혼합에 사용된다. US2002117167A에는 적어도 일부의 헤미셀룰로스를 가용화시키고, 가용화된 헤미셀룰로스를 가수분해시켜 하나 이상의 모노사카라이드를 제조하는 것을 포함하는, 바이오매스 물질에서의 헤미셀룰로스의 효소적 가수분해가 기재되어 있다. 이용된 바이오매스는 바람직하게는 원료 물질 또는 전처리된 물질의 수성 슬러리이다. 바이오매스 물질은 헤미셀룰로스를 포함하는 임의의 셀룰로스성 물질일 수 있다. 상기 방법은 곡류 섬유 (예컨대, 옥수수, 밀, 쌀, 귀리 또는 보리)의 사용시에 특히 유효하다고 기재되어 있다. US2004005674A에는 리그노셀룰로스의 효소적 가수분해 방법이 기재되어 있다. 리그노셀룰로스의 당으로의 분해는 리그노셀룰로스를 하나 이상의 보조 효소 및 하나 이상의 셀룰라제와 접촉시키는 것을 포함한다. 리그노셀룰로스성 물질은 분쇄되고 (물질의 평균 섬유 크기는 더 구체화되지 않음), 낮은 건조물 함량 (10 ml의 효소 용액 중 0.2 g의 분쇄된 스토버 (stover) 물질)을 갖는다. 003c#발명의 요약003e# 본 발명은 상대적으로 높은 건조물 함량, 바람직하게는 20％ 초과의 건조물 함량을 갖고, 바람직하게는 20％ (w/w) 이상의 바이오매스가 26 내지 70 mm 내에 범위하는 섬유 및 입자 크기의 분포를 갖는, 바람직하게는 상대적으로 큰 섬유 및 입자로 구성된 폴리사카라이드 함유 바이오매스의 액화 및 사카린화 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법은 전분, 정제 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌으로 1차적으로 구성된 폴리사카라이드 함유 바이오매스, 예를 들어 곡류 또는 밀 줄기 (straw)의 액화 및 사카린화에 특히 적합하다. 리그노셀룰로스성 바이오매스의 경우에, 이들은 바람직하게는 110 내지 250℃의 온도에서 1 내지 60분 동안에 셀룰로스의 효소로의 접근성을 확보하고, 동시에 전처리된 바이오매스에서의 발효 억제제의 제한된 함량을 확보하는 방식으로 전처리된다. 본 발명은 탄수화물 분해 효소를 비롯한 가수분해 효소와 산화 효소의 조합에 기반한 효소적 가수분해를, 기계적 힘 (1차적으로 전단력 및 파열력)을 바이오매스에 적용하는 것을 보장하는 중력의 원칙에 의존하는 소정 유형의 혼합과 병행한다. 바람직한 유형의 혼합은, 예를 들어 자유 낙하 혼합기, 예컨대 드럼 혼합기, 텀블 혼합기 또는 유사한 혼합 장치에서 이루어진다.