마이코박테리움의 일렉트로포레이션 및 마이코박테리움에서항원의 과발현 document_id A220623052660

마이코박테리움 튜베르큘로시스(M.tb)는 전 세계 인구의 1/3을 감염시켜 왔으며, 매년 8백만 명에서 활동성 질병을 일으키고 160만 내지 220만 명이 사망하였으며, 이들 중 대부분은 개발도상국 국민이다. 결핵(TB)은 HIV의 만연과 엇갈려 점점더 증대하고 훨씬 더 치명적으로 되고 있는 세계적인 규모의 전염병이다. TB는 AIDS에 걸린 사람의 제 1급 살인자이다. 현재 광범위하게 사용되고 있는 TB 백신인 BCG는 80년 전에 개발되었으며 시험 시 폐결핵에 대한 효능은 광범위하게 가변적인 비율을 가졌고, 인도에서 수행된 최종의 대규모 시험에서는 효능이 없었다(Fine et al., Vaccine, 16(20):1923-1928; 1998; Anonymous, Indian J Med Res., Aug;110:56-69; 1999). 그럼에도 불구하고, 세계 보건 기구는 현재 TB가 매우 유행하고 있는 국가에서 모든 아동들(HIV 질병/AIDS 증상이 있는 아동 제외)에게 출생 시 또는 공공 의료 서비스와 최초 접촉 시 BCG를 권장하고 있다. 이러한 정책은 BCG가 TB의 심각한 아동기 형태를 방지하는 증거를 근거로 한다(Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5):1042-1049; 1995; Rodrigues et al., J Epidemiol Community Health 45(1):78-80; 1991). 초기 아동기 이후의 TB에 대한 BCG에 의한 보호는 혼합된 결과를 제공하는 제한된 데이터와 함께 논의의 여지가 있는 주제이다. 그러나, 유아 BCG 면역이 광범위하게 실시되는 개발 도상국에서 소아 및 성인 TB의 높은 발병률은 현재 투여되는 BCG가 TB 질병의 위험이 있는 사람들에게는 수년간에 걸쳐 그 다지 효능이 없음을 가리킨다. 따라서, BCG는 TB의 중재 및 억제에 부적합한 공중 보건 도구인 것으로 간주된다. TB 유기체에 노출된 인간의 대략 70％ 및 정상적인 면역계를 갖는 인간은 감염되지 않으며, 감염된 사람들 중 단지 약 5％만이 처음 2 년 내에 발병한다. 감염된 개인의 대부분은 상기 감염을 억제하며, 이는 엠 티비 항원에 대한 강건한 세포 면역 반응의 발생과 관련이 있다. 추가로 5％는 면역성이 쇠퇴하는 경우 나중에 활동을 재개한다. 최초 및 재활동 질병은 모두 HIV/AIDS 환자에서 훨씬 더 흔하며, 이는 감염의 예방 및 억제에서 면역성의 역할을 다시 한번 강조한다. 발명의 요약 대부분의 인간은 TB를 억제할 수 있기 때문에, 적합한 종류의 면역성이 오래 지속되도록 유도함으로써 노출 후 초기 감염을 방지하고, 질병으로의 조기 진행을 방지하고, 잠재적인 상태로부터의 재활동을 방지하고, 치료 후 재발을 방지하는 유효 백신을 개발할 수 있음을 희망하는 것은 타당하다. 궁극적으로, 전신 백신 사용 + 화학요법적 중재의 조합은 결국 인간 병원체로서 엠 티비를 제거할 것이다. 아동기 BCG 예방접종이 급성 TB의 예방을 수행하는 것으로 생각되는 중요한 역할에 비추어, 새로운 TB 백신이 우수한 제품이라는 증거를 간과하지 않으면서 후보 TB 백신을 평가하는 시험에 BCG를 대체하기는 어렵다. 문제는 엠 티비가 인간 특이성 병원체이며 동물 모델은 단지 숙주-병원체 상호작용의 일부를 모방한다는 것이다. 따라서, 새로운 TB 백신이 개선된 효능을 갖는다는 명확한 증거는 오직 인간에서 조절된 방면의 시험으로부터 획득할 수 있다. 이러한 사실은 많은 연구자들로 하여금 개선된 TB 백신을 향한 중요 단계가 상기의 제한에도 불구하고 개선된 BCG 균주 및 동물 모델을 개발하는 것이라는 결론을 내리게 하였으며, 이는 보호 항원을 과발현하는 재조합 BCG가 BCG에 비해 증가된 효능을 가짐을 암시한다. 몇몇 엠 티비 항원은 백신 성질을 가지며, 백신 제형으로서 동물에게 제공될 때, BCG만에 의해 성취된 바와 유사한 보호를 부여한다(Anderson, Infect Immun 62(6)2536-2544; 1994). 이러한 후보들을 진보시키기 위해서, BCG에서 상기와 같은 항원의 면역원성을 향상시키는 전략이 개발되었다. 따라서, 선택된 엠 티비 항원을 과발현하는 BCG 균주를 개발하였으며 상기 재조합 BCG(rBCG) 균주는 상기 rBCG 균주가 유래하는 모 BCG 균주에 비해 보다 강한 보호를 유도하는 것으로 나타났다(Horwitz et al., Infect Immun 72(4):1672-1679; 2003). 한 연구에서, 항원 85B(본 발명에서 "Ag85B"라 칭함)를 발현하는 rBCG 균주가 동일 항원과 혼합된 BCG보다 더 효능 있는 것으로 나타났다(Horwitz et al., 상기, 2003). 이러한 발견을 근거로, 상기 접근법은 굉장한 가능성을 갖는다. 몇몇 상황 하에서 항원을 과발현하는 BCG 균주를 사용하여 TB에 의한 감염으로부터의 보호를 부여하는 면역 반응을 안전하고 유효하게 유도할 수 있다. 본 발명은 결핵에 대한 백신화제로서 사용하기 위한 개선된 백신 성질을 갖는 유전자 가공된(재조합) 마이코박테리움 균주를 제공한다. 상기는 다양한 특징들을 가지며, 이들은 각각 상기 균주의 면역원성을 증가시키는 작용을 한다. 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주를 그의 효능 있는 면역원성에 대해 의도적으로 선택된 모 균주로부터 발생시킨다. 즉, 유전자 조작을 겪도록(예를 들어 결핵 항원을 과발현하도록) 모 균주로서 선택된 마이코박테리움 균주를 선택하는데, 그 이유는 유전자 조작 전이라도, 상기가 백신화된 숙주에서 효능 있는 면역 반응을 유도하는 능력을 나타내기 때문이다. BCG 균주 데니쉬 1331이 일례이다. 이어서 상기와 같은 균주를 바람직하게는 예를 들어 관심 결핵 항원을 과발현하도록 변경시킨다. 바람직하게는, 생체 내 활성화되는 프로모터를 유전자 재조합 마이코박테리움에 사용한다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주를 항생제 내성에 의한 것 이외의 것을 기준으로 선택 가능하도록 유전자 가공하거나, 또는 선택 마커가 전혀 필요하지 않은 방식으로 제작하여, 상기를 인간 집단에서 백신화제로서 안전하게 사용할 수 있게 한다. 일례로서, 마이코박테리움 복제에 필요한 유전자를 제거하여 발현 플라스미드에 넣는다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 그람 음성 세균으로의 수평 전이를 겪지 않으며 따라서 숙주 유기체로부터 "이탈"할 수 없다. 이는 또한 인간 집단에서 백신제로서의 상기의 안전성을 보장한다. 또 다른 예로서, 본 발명은 플라스미드 안정화 인자로서 플라스미드에 의한 항원 85b 발현의 용도를 개시하며, 이는 상기 항원의 유지를 위한 항생제 선택 필요성을 없앤다. Ag85B + 다른 항원을 발현하는 고 농도의 최소 플라스미드로, 마이코박테리움 균주의 동정을 위한 PCR 양성 선택을 사용하여 상기 균주를 직접 형질전환시켜 항생제 부재 하의 플라스미드 안정성 또는 영양요구성 선택을 갖는 항원을 과발현하는 마이코박테리움 균주를 생성시킨다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 결핵 백신에 사용하기에 탁월한 작용제이지만, 상기를 또한 결핵과 관련된 것 이외의 항원을 발현 또는 과발현하도록 유전자 가공할 수 있으며, 따라서 상기는 또한 다른 질병에 대한 백신제로서도 유용하다. 더욱 또한, TB 항원 또는 다른 질병에 중요한 항원을 과발현하는 rBCG를, 추가접종제로서 항원보강제, 재조합 바이러스 벡터, 또는 DNA 또는 RNA 백신과 함께, 재조합 단백질과 1 차 추가접종 섭생에 사용할 수 있다. 본 발명은 형질전환된 세균(또는 자손)을 복제하고 상기에서 발현되는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 형질전환된 세균 또는 그의 자손을 제공하며, 이때 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 선택성 마커에 결합되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 상에 존재하며, 일부 실시태양에서, 상기 플라스미드는 생존에 필요한 유전자를 암호화하고, 이때 상기 생존에 필요한 유전자는 상기 형질전환된 세균의 세균 게놈으로부터 결실되어 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 엔도솜 이탈을 암호화하는 유전자, 예를 들어 pfo를 함유한다. 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 엔도솜 이탈, 예를 들어 pfo를 암호화한다. 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 항원 85a, 항원 85b 또는 항원 85a/85b를 암호화한다. 더욱 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 상기 플라스미드를 유지하고/하거나 안정화하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질 암호화 유전자는 항원 85a, 항원 85b, 또는 항원 85a/85b를 암호화한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 세균은 마이코박테리움이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 세포자멸을 암호화한다. 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 세포자멸을 암호화하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 그람 음성 세균에서 복제될 수 없다. 일부 실시태양에서, 상기 형질전환된 세균은 영양요구성이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 일방 셔틀 벡터(one-way shuttle vector)의 적어도 일부이다. 본 발명은 또한 세균을 형질전환시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세균을 복제하고 상기에서 발현되는 외부 뉴클레오타이드 서열을 통합시키는 단계를 포함하며, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 선택성 마커에 결합되지 않는다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 통합 단계를 일렉트로포레이션에 의해 수행한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 상에 있으며 일렉트로포레이션을 하기의 조건 하에서 수행한다: 1 내지 5 ㎍의 플라스미드 DNA 대 1.25 x 108 세균 세포 범위의 플라스미드 DNA 대 세균 세포의 비. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 비는 대략 1.6 ㎍의 플라스미드 대 대략 1.25 x 108 세균 세포이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 그람 음성 세균에서 복제될 수 없다. 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 일방 셔틀 벡터의 적어도 일부이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 상에 위치하며 상기 세균의 세균 게놈으로부터 결실된, 생존에 필요한 유전자를 암호화한다. 본 발명은 또한 관심 유전자를 암호화하는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 제공하며, 이때 하기의 조건들 중 하나 이상이 존재한다: a) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 그람 음성 세균을 복제할 수 없는 플라스미드를 포함한다; b) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 항생제 내성을 나타내지 않는다; c) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 영양요구성이다; 및 d) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 일방 셔틀 벡터를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드의 일부이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드에는 선택 마커가 결여되어 있다. 본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 생존에 필요한 유전자를 암호화하며, 상기 생존에 필요한 유전자는 상기 형질전환된 마이코박테리움의 세균 게놈으로부터 결실된다. 일부 실시태양에서, 상기 생존에 필요한 유전자는 leuD이다. 상기 형질전환된 마이코박테리움 또는 자손은 생체 내에서 활성화되는 프로모터 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 감독시킬 수 있다. 상기 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손은 BCG일 수 있으며, 이의 예로는 BCG1331, BCG 파스퇴르, BCG 토쿄, 또는 BCG 코펜하겐이 있을 수 있다. 본 발명은 또한 관심 유전자를 암호화하는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 포함하는 백신을 제공하며, 이때 하기의 조건들 중 하나 이상이 존재한다: a) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 그람 음성 세균을 복제할 수 없는 플라스미드를 포함한다; b) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 항생제 내성을 나타내지 않는다; c) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 영양요구성이다; 및 d) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 일방 셔틀 벡터를 포함한다.