시토신의 화학적 변형에 의한 미생물 핵산의 단순화 방법 document_id A220623052680

특정 핵산 분자의 검출에 많은 절차들이 현재 이용될 수 있다. 이들 절차들은 통상적으로 표적 핵산과 짧은 올리고뉴클로오티드(20 염기 이하)에서 수 킬로베이스(kb)의 서열 길이를 갖는 핵산 탐침 사이의 서열-의존 혼성화에 의존하고 있다. 핵산 서열 집단 내로부터 특정 서열의 증폭을 위해 가장 널리 사용되는 방법은 PCR(polymerase chain reaction, Dieffenbach, C and Dveksler, G. eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)이다. 이 증폭 방법에 있어서, 일반적으로 상보적인 DNA 가닥 상에서 그리고 증폭될 부위의 양 말단의 어느 하나에 있어서 길이로 20 내지 30 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 변성된 단일-가닥 DNA 상에서 DNA 합성을 준비하기 위해 사용된다. 열에 안정한 DNA 폴리머라제를 이용한 변성, 초기 혼성화 및 DNA 가닥 합성의 연쇄적인 사이클들은 프라이머 사이에서 서열을 지수 함수적으로 증폭시킨다. RNA 서열은 먼저 cDNA(complementary DNA) 사본을 생산하는 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 복사에 의해 증폭될 수 있다. 증폭된 DNA 단편은 겔 전기영동, 표지된 탐침을 갖는 혼성화, 후속 동정(예를 들어 효소 관련 분석에 의함)이 필요한 표지 프라이머(tagged primers)의 이용, 및 표적 DNA와 혼성시에 신호를 발생시키는 형광-표지된 프라이머의 이용(예를 들어 Beacon 및 TaqMan 시스템)을 포함하는 수많은 수단에 의해 검출될 수 있다. PCR뿐만 아니라, 다른 많은 기술들이 특정 핵산 서열의 검출 및 증폭을 위해 발전되어 왔다. 한 예는 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction, Barany, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193)이다. 다른 예는 1992년에 처음으로 기재된 등온 증폭(isothermal amplification), (Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992)으로 SDA(Strand Displacement Amplification)로 불린다. 그 이후로, 대응하는 게놈 DNA가 아닌 RNA 서열을 복사하는 RNA 폴리머라제를 이용하는 TMA(Transcription Mediated Amplification) 및 NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)를 포함하여 다른 많은 등온 증폭 기술들이 기술되어 왔다(Guatelli JC, Whitfield KM, Kwoh DY, Barringer KJ, Richmann DD and Gingeras TR. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. PNAS 87: 1874-1878 (1990); Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schukkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991 Dec; 35(3):273-86). 다른 DNA-기초 등온 기술들은 DNA 폴리머라제가 원형 주형에 향한 프라이머를 연장시키는 것인 RCA(Rolling Circle Amplification, Fire A and Xu SQ. Rolling replication of short circles. PNAS 92: 4641-4645, 1995), 표적 검출을 위해 원형 탐침을 이용하는 RAM(Ramification Amplification, Zhang W, Cohenford M, Lentrichia B, lsenberg HD, Simson E, Li H, Yi J, Zhang DY. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol. 2002 Jan; 40(1): 128-32), 및 더 최근에는 열 대신 DNA 가닥을 푸는 헬리카아제 효소를 이용하는 헬리카아제-의존 등온 DNA 증폭(HDA, Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug; 5(8):795-800)을 포함하고 있다. 최근, DNA 증폭의 등온 방법이 기재되었다(Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992). 통상적인 증폭 기술은 증폭 반응의 각 사이클에서 표적 분자의 변성 및 재생의 계속되는 사이클에 의존하고 있다. DNA의 열 처리는 DNA 분자의 어느 정도의 절단을 초래하여, DNA가 발달하는 배반포(blastocyst)로부터 작은 수의 세포들로부터의 DNA 분리로 제한될 때, 또는 특히 DNA가 단편화된 형태, 이를 테면 조직 박편, 파라핀 블락 및 오래된 DNA 샘플인 경우에, 이 가열-냉각 사이클은 DNA에 손상을 더 줄 수 있고 증폭 시그날의 손실을 초래할 수 있다. 등온 방법은 다른 증폭으로부터 주형으로 사용되는 단일 가닥 분자를 생산하기 위해 주형 DNA의 계속적인 변성에 의존하는 것이 아니라, 일정 온도에서 특정 제한 엔도뉴클레아제에 의한 DNA 분자의 효소적인 닉킹(nicking)에 의존한다. 사슬 치환 증폭 (SDA; Strand Displacement Amplification)이라 불리는 기술은 반-변형된 DNA의 변형되지 않은 가닥을 닉킹시키는 특정 제한 효소의 능력 및 하류 가닥을 연장 및 치환시키는 5'-3' 엑소뉴클레아제-결함 폴리머라아제의 능력에 의존하고 있다. 지수 함수적 증폭은 센스 반응으로부터의 가닥 치환을 위한 안티 센스 반응을 위한 주형으로서 이용되는 센스 및 안티센스 반응의 커플링으로 인해 성취된다(Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992). 그런 기술들을 이용하여 다음 미생물의 증폭에 성공하였다: 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis, Walker GT, Little MC, Nadeau JG and Shank D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. PNAS 89: 392-396, 1992), HIV-1, 간염 C 및 HPV-16 (Nuovo G. J., 2000), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis, Spears PA, Linn P, Woodard DL and Walker GT. Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis. Anal. Biochem. 247: 130-137, 1997). 지금까지 SDA의 이용은 변형 가닥 상에서 효소 분해에 저항하여 소화 대신에 효소적 니킹(nicking)을 초래하여 치환 반응을 이끄는 헤미-포스포티오에이트 DNA 듀플렉스를 생산하기 위해 변형된 포스포티오에이트 뉴클레오타이드에 의존한다. 그러나, 최근, 몇몇 "닉케이즈(nickase)" 효소가 설계되었다. 이들 효소들은 통상적인 방식으로 DNA를 절단하지 않고 DNA 가닥 중 하나에 틈 (a nick)을 발생시킨다. "닉케이즈" 효소는 N.AIwi (Xu Y, Lunnen KD and Kong H. Engineering a nicking endonuclease N.AIwi by domain swapping. PNAS 98: 12990-12995 (2001), N.BstNBI (Morgan RD, Calvet C, Demeter M, Agra R, Kong H. Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease . N.BstNBI. Biol Chem. 2000 Nov;381 (11 ):1123-5.) 및 MIyI (Besnier CE, Kong H. Converting MIyI endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep. 2001 Sep;2(9):782-6. Epub 2001 Aug 23)을 포함한다. 그런 효소들의 이용이 SDA 과정을 간편화시킨다. 추가로, SDA는 열안정성 제한효소(Aval) 및 열안정성 엑소-폴리머라아제(Bst 폴리머라아제)의 조합하여 이용함으로써 개선되었다. 이 조합은 반응의 증폭 효율을 108배 증폭에서 1010배 증폭으로 향상시켜, 이 기술을 이용하면 특정 단일 카피 분자의 증폭이 가능함을 보여주었다. 열안정성 폴리머라아제/효소 조합을 이용하는 결과 얻게되는 증폭 인자는 약 109이 된다(MiIIa M. A., Spears P. A., Pearson R. E. and Walker G. T. Use of the Restriction Enzyme Aval and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques 1997 24:392- 396). 지금까지, 모든 등온 DNA 증폭 기술은 증폭을 개시하기에 앞서 초기 이중 나선 주형 DNA 분자가 변성될 것이 요구되었다. 추가로, 증폭은 오직 각 프라이밍 시(event)로부터 오직 한 번만 개시된다. 직접 검출을 위하여, 표적 핵산은 표적 서열에 상보적인 탐침과의 혼성화(서던 및 노던 블럿팅)에 앞서 겔 전기영동에 의한 크기에 기초하여 가장 일반적으로 분리되고 고체 지지체에 옮겨진다. 탐침은 천연 핵산 또는 PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 또는 INA(intercalating nucleic acid)와 같은 유사체일 수 있다. 탐침은 직접적으로 표지될 수 있고(예를 들어 32P로) 또는 간접적 검출 고정이 이용될 수 있다. 간접적 과정은 보통 비오틴 또는 디곡시제닌(digoxigenin)과 같은 "태그(tag)"를 프로브에 통합시키는 것에 의존하고 그 탐침은 효소-결합된 기질 전환 또는 화학발광과 같은 수단에 의해 검출된다. 널리 이용되는 핵산의 직접 검출의 다른 방법은 "샌드위치" 혼성화이다. 이 방법에 있어서, 캡쳐 탐침은 고체 지지체에 결합되어 있고, 용액 내의 표적 핵산이 결합된 탐침과 혼성화된다. 결합되지 않은 표적 핵산은 세척되고 결합된 핵산은 표적 서열과 혼성화되는 두 번째 탐침을 이용하여 검출된다. 검출은 상기에서 기재한 것처럼 직접 또는 간접적인 방법을 이용할 수 있다. 그런 방법들의 예는 샌드위치 혼성화 원리를 이용하는 예로서 "가지 DNA(branched DNA)" 신호 검출 시스템을 포함한다(1991 , Urdea, M. S., et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 24,197-200). 핵산 서열의 직접 검출을 위해 핵산 혼성화를 이용하는 급성장하고 있는 분야는 DNA 마이크로어레이이다(2002, Nature Genetics, 32, [Supplement]; 2004, Cope, L.M., et al., Bioinformatics, 20, 323-331; 2004, Kendall, S.L., et al., Trends in Microbiology, 12, 537-544). 이 과정에서, 짧은 올리고뉴클레오타이드(Affymetrix 시스템에서 통상적으로 25-머)에서 긴 올리고뉴클레오타이드(Applied Biosystems 및 Agilent platforms에서 통상적으로 60-머)까지, cDNA 클론과 같은 더 긴 서열까지의 범위를 갖는 개별 핵산 종류들은 격자 배열로 고체 지지체에 고정되거나 고체 지지체 상에서 포토리소그래피적으로 합성된다. 태그 또는 표지된 핵산 집단은 어레이로 혼성화되고, 어레이 상에서 각 스팟의 혼성화 정도가 정량화된다. 다른 검출 시스템, 이를 테면 화학 발광 같은 것이 사용될 수 있다 하더라도, 가장 일반적으로, 방사성 표지 또는 형광 표지된 핵산(예를 들어 cRNAs 또는 cDNAs)들이 혼성화를 위해 사용된다. 핵산 서열의 직접 검출을 위해 핵산 혼성화를 이용하는 급성장하는 분야는 DNA 마이크로어레이 분야이다(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays. Cell 102: 9-15 (2000); Watson A New tools. A new breed of high tech detectives. Science 289:850-854, 2000). 이 과정에서, 짧은 올리고뉴클레오타이드(Affymetrix 시스템에서 통상적으로 25-머)에서 긴 올리고뉴클레오타이드(Applied Biosystems 및 Agilent platforms에서 통상적으로 60-머)까지, cDNA 클론과 같은 더 긴 서열까지의 범위를 갖는 개별 핵산 종류들은 격자 배열로 고체 지지체에 고정된다. 태그 또는 표지된 핵산 집단은 어레이로 혼성화되고, 어레이 상에서 각 스팟의 혼성화 정도가 정량화된다. 다른 검출 시스템이 사용될 수 있다 하더라도, 가장 일반적으로, 방사성 표지 또는 형광 표지된 핵산(예를 들어 cDNAs)들이 혼성화를 위해 사용된다. 박테리아, 효소 및 진균과 같은 미생물의 검출을 위한 통상적인 방법들은 선택 영양 배지에서 미생물을 배양하여 크기, 모양, 포자 생산, 생화학적 또는 효소적 반응과 같은 특성 및 통상적인 빛 현미경 아래에서 보여지는 특정 염색 특성(이를 테면 그램 염색)에 기초한 미생물 분류를 포함한다. 바이러스 종들은 분화된 조직 또는 세포 내에서 성장되고, 전자 현미경에 의해 측정된 그들의 구조 및 크기에 기초하여 분류된다. 이런 기술들의 주요 결점은 모든 미생물들이 그런 접근의 유용성을 제한시키는 통상적인 배양 또는 세포 조건 하에서 성장할 수 없다는데 있다. 예를 들어, 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(모두 수막염을 일으키고, 그 중에서 N. 메닌지티디스는 수막염과 전격형 수막염균혈증을 일으킨다)와 같은 박테리아의 경우, 이들 세 가지 종들은 모두 배양하기 힘들다. 혈액 배양 병이 최고 7일 동안 매일 정기적으로 검사되고 2차 배양이 요구된다. H. 인플루엔자는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클로오타이드 및 해민(haemin)이 모두 함유된 특수한 배지를 요구하고 초콜렛 아가 플레이트(Chocolate Agar Plates) 상에서 성장한다. 혈액 배양은 트립티카제 소이 브루스(trypticase soy broth) 또는 뇌 심장 추출물 BHI(brain heart infusion) 및 소듐 폴리아네톨설포네이트(sodium polyanetholesulphonate)와 같은 다양한 첨가제들의 첨가를 요구한다. 심한 식중독 및 플러피 베이비 신드롬(floppy baby syndrome)을 야기시키는 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum)과 같은 미생물의 경우, 독소의 동정은 식품 추출물 또는 배양 상청액을 마우스에 주입하여 그 2일 후에 결과를 가시화시키는 것과 관련있다. 추가로, 특수 배지 상에서 잠재 미생물을 배양하는 것은 일주일이 걸린다. 스타필로코커스 아우레우스 장독소taphylococcus aureus enterotoxin)(식중독 뿐만 아니라 피부 감염, 혈액 감염, 폐렴, 골수염, 관절염 및 뇌농양의 원인)은 이온 교환 수지 또는 모노클로날 항체를 이용한 역수동 라텍스 응집(Reverse Passive Latex Agglutination)을 통해 독소의 선택적 흡수로 인하여 소량 검출된다. 이것에 상대적으로, S. 에피데르미스(S. epidermis)는 혈액감염을 일으키고 장비와 병원의 벽 등의 표면들과 의료 기계 및 기기의 표면을 오염시킨다. 비-바이러스 미생물은 또한 글루코스, 말토스 또는 수크로스와 같은 기질 상에서의 발효 반응 동안의 특정 아미노산의 생산 또는 대사 산물과 같은 대사적 성질에 기초하여 분류된다. 부가로, 미생물들은 항생제에 대한 민감성에 따라 유형지어 질 수 있다. 세포 표면에 대한 특정 항원 또는 분비된 단백질, 이를 테면 독소에 대한 특정 항원은 또한 미생물을 동정하고 분류하는데 이용될 수 있다. 그러나, 상기 모든 방법들은 그 후의 테스팅에 앞서 미생물의 배양에 의존하고 있다. 미생물의 배양은 값비싸며 시간이 소모되고, 또한 까다롭지 않은 미생물에 의한 오염 및 그러한 미생물이 과성장되는 문제가 발생할 수 있다. 최종 진단에 도달하기 위하여 많은 실험들이 동일한 샘플 상에서 수행되어야만 하는 경우에 있어서 기술들이 상대적으로 조잡하다. 대부분의 미생물들은 기존 배지에서 용이하게 성장될 수 없고, 그러므로 그들은 야생에서 다른 종의 미생물과 통상적으로 혼합된 집단이 존재하거나 고등 생물과 연관되어 존재할 때 검출 수준에 미치지 못한다. 병원성 미생물들의 검출 및 동정을 위한 다른 방법은 항체들이 그 미생물로 인한 감염에 대한 반응으로 생산되는 혈청학적 접근에 기초한다. 예를 들어, 메닌고코씨(Meningococci)는 그들의 캡슐 폴리사카라이드에 있어서 구조적 차이에 근거하여 분류될 수 있다. 이들은 다른 항원성을 가지고 있어 5개의 주요 혈청그룹(A, B, C, Y 및 W-135)으로 판정될 수 있다. ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assays) 또는 RIA(Radio lmmuno Assay)는 그런 항체의 생산을 평가할 수 있다. 이들 양 방법은 감염 동안 숙주 동물에 의해 생산된 특정 항체의 존재를 검출한다. 이들 방법들은 숙주 동물에 의해 항체가 생산되는데 어느 정도 시간이 소요되어 종종 초기 감염은 놓치는 약점을 가지고 있다. 추가로, 그런 분석들을 이용하더라도 과거의 감염과 현재 감염을 신뢰성 있게 구분할 수도 없다. 더욱 최근에, 감염 질환의 진단을 위한 분자적 방법의 이용에 많은 관심이 있었다. 이들 방법들은 병원성 미생물의 민감하고 특이적인 검출을 제공한다. 그런 방법들의 예는 "가지 DNA(branched DNA)" 시그널 검출 시스템을 포함한다. 이 방법은 샌드위치 혼성화 원리(Urdea MS et al. Branched DNA amplification multimers for the sensitive, direct detection of human HIV^and hepatitis viruses. Nucleic Acids Symp Ser. 1991 ;(24):197-200)를 이용하는 예이다. 박테리아의 검출 및 분류를 위한 다른 방법은 16S 리보솜 RNA 서열을 증폭시키는 것이다. 16S rRNA는 다양한 임상 또는 환경 샘플에서 박테리아 종의 검출을 위한 PCR 증폭 분석에 이용하기 위한 적절한 표적이 되는 것으로 보고되고 16S rRNA 유전자가 종-특이적 다형성(polymorphisms)(Cloud, J. L., H. Neal, R. Rosenberry, C. Y. Turenne, M. Jama, D. R. Hillyard, and K. C. Carroll. 2002. J. Clin. Microbiol. 40:400-406)을 보여주기 때문에 다양한 특이 미생물을 동정하는데 자주 이용되어 왔다. 그러나, 박테리아의 순수 배양이 요구되고 PCR 증폭 이후에 샘플은 여전히 종을 측정하는 마이크로어레이 타입 장치에 나열되어 있거나 혼성화되어 있다(Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H, Nagai H, lto K, Kawaguchi R. J Clin Microbiol. 2003 Jun; 41(6):2605-15). 그런 방법들은 고가이며, 시간이 소모되고 노동 집약적이다. 본 발명자들은 임의 미생물 종을 위한 일반적 검출 또는 초기 스크리닝 분석에 적합한 미생물 검출의 새로운 방법들을 개발하였다.