고 수준의 인터페론 베타를 제조하는 방법 document_id A220623052813

인간에서 세 가지 주요한 유형의 인터페론이 확인되었다: 알파-, 베타- 및 감마-인터페론. 이들은 바이러스, 유사분열물질(mitogen), 폴리뉴클레오티드 등에 노출 시 다양한 세포들에 의해 생산된다. 그들은 항-바이러스성, 항-증식성 및 면역조절(immunomodulatory) 특성을 갖는다. 인터페론-베타(IFN-β)는 다발성 경화증[Corboy JR et al., Current Treatment Options in Neurology, 5, 35-54 (2003)], B형 간염 및 C형 간염의 효과적인 치료제로 이용된다. 세린이 17번 위치의 시스테인을 치환하도록 유전적으로 조작된 인간 IFN-β의 유사체인 베타세론(Betaseron)은 IFN-β 1b(US 4588585)로 알려져 있다. 이 분자는 하나의 디술피드 결합을 갖는, 165개의 아미노산으로 구성된 소형 폴리펩티드이고 비-당화된(non-glycosylated) 단백질로 생산된다. IFN-β 1a로 알려진, IFN-β의 당화된 변이체는 80번 위치에 탄수화물 사슬을 가지며 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현된다[Conradt et al., J. Biol. Chem., 262, 14600-5 (1987); Kagawa et al., J. Biol. Chem., 263, 17508-15 (1988); Oh et. al., Biotechnol Prog., 21, 1154-64 (2005); US 5795779 (McCormik et al); US 5554513 (Revel et al)]. IFN-β는 초기에 백혈구를 바이러스로 처리하여 유도하는 것에 의해 생산되었다. 그러나, 이 방식으로 생산된 인터페론-β의 치료적 용도는 그와 같은 제제 내에 다양한 오염물(예를 들면, 바이러스)이 존재할 수 있는 높은 가능성 때문에 의문시된다. 재조합 기술은 바이러스 오염을 포함하지 않는 IFN-β를 생산하는 것을 가능하게 하였다. 원형의(native) IFN-β는 당단백질(glycoprotein)이고, 그 생산은 각각 Mantei et al., Nature 297: 128 (1982); Ohno et al., Nucl Acid. Res. 10: 967 (1982); 및 Smith et al., MoL Cell. Biol. 3: 2156 (1983)에 기재된 바와 같이 포유동물, 곤충 및 효모 세포에서 보고되었다. US 5795779 (McCormick et al.)는 재조합 CHO 세포로부터 고수준의 IFN-β 생산을 개시한다. US 5554513 (Revel et al.)은 두 가지 서브타입의 IFN-β를 개시하고 CHO 세포에서 이를 생산하는 방법을 기재한다. 그러나, 모든 상용화된 동물 세포 배양 방법은 보다 긴 공정 시간, 엄격한 배양 조건 유지의 요구, 고 비용의 배양 배지 등과 같은 기술적 어려움과 연관된다. 또한, 당화는 단백질의 생물학적 활성에서 역할을 수행하지 않는 것으로 입증되었고[Taniguchi, et al., Gene 10, 11-15 (1980); E. Knight Jr., Proc. Natl. Acad. ScL , 73, 520 (1976); E. Knight Jr. and D. Fahey, J. Interferon Res. 2(3), 421 (1982)], 이에 의해 통상적으로 이용되는 숙주인 대장균에서 생산을 수행하는 것의 장점이 강조되었다[Saraswat et al. FEMS Microbiology Lett., 179, 367-73 (1999); Holowachuk 0026# Ruhoff, Protein Expr. Purif. 6, 588-96 (1995); Kim et. al, Biotechnol. 0026# Bioeng., 69, (2000); Kim et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 24 (2001); Saraswat et. al. Biotechnol. Lett., 22, 261-5 (2000); Lee et. al, FEMS Microbiology Lett., 195, 127-132 (2001); Saraswat et. al. Biochemistry, 41, 15566-77 (2002); Wang et al., Chin. J. Biotechnol. 11, 45-81 (1995)]. IFN-β는 대장균에서 클로닝되고 발현되었다(Taniguchi, et al., Gene 10, 11-15 (1980). EP 0048970(Goeddel et al.)은 성숙한 인간 섬유아세포 인터페론의 미생물에 의한 생산을 기재한다. 임의의 치료용 단백질의 경우와 같이, 상업적 목적을 위해 고수준의 인터페론-β를 수득하는 것이 바람직하다. EP 0036776(Kield et al.)은 세균에서 이종기원(heterologous) 단백질의 효율적인 생산을 위한 트립토판 프로모터-오퍼레이터 시스템에 기반한 신규한 벡터를 개시한다. US 4686191(Itoh et al.)은 단백질 합성의 효율성을 증가시키기 위해, trp 프로모터를 갖는 개선된 벡터를 이용하는 것에 의한 대장균에서 인터페론-β의 효율적인 발현을 수득하는 방법을 개시한다. US 4499188(Konrad et al.)은 trp 프로모터가 인터페론-β 생산을 위해 이용되는 경우, 배양 동안 억제자(repressor) 수준을 모니터링하는 것의 문제를 해결하는 것으로 주장한다. US 4746608에서 Mizukami 등은 고 수율의 인터페론-β를 수득하기 위해, 최적의 성장 온도보다 10 내지 25℃ 낮은 온도에서 재조합 미생물을 배양하는 방법을 제안한다. US 4656132에서 Ben-Bassat 등은 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 수용성 알칸올 및/또는 배양의 말기 동안 세균 성장을 지원하는 아미노산 혼합물의 유효량의 첨가에 의해 인터페론-β의 낮은 수율의 문제를 해결하는 것으로 주장한다. US 5866362에서 Cousens 등은 유효량의 Cu++를 포함하는 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 인터페론-β를 단백질 집합체(protein aggregates)로 생산하여 그들이 숙주 세포 내에서 봉입체(inclusion body)를 형성하고 이로부터 단백질이 분리되고 정제될 수 있게 하는 방법을 제안했다. 그러나, 이 방법들 중 어느 것도 인터페론-β의 만족스러운 수준을 달성할 수 없었다. 인터페론-β의 소수성 때문에, 합성된 단백질은 세포 성장을 방해하고 따라서 인터페론-β의 생산이 상당히 높은 수준으로 달성되지 않는다. US 5814485에서 Dorin 등은 형질전환된 숙주 세포에서 인터페론-β 같은 소수성 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 특정한 조건을 개시한다. 상기 발명(US 5814485)의 중요한 조건은 단백질 생산의 유도 동안 120 mM 이하의 포타슘 농도 및/또는 40 mM 이하의 소디움 이온 농도 및/또는 4.8 내지 6.8의 pH이다.