티미딘 키나아제 활성을 결정하는 방법 및 키트 및 그의용도 document_id A220623053237

세포 분열 전에, 유전 정보를 담고 있는 DNA는 DNA-중합효소에 의해 복제되어야 한다. 이는 다른 필요한 성분들 중에서도, 다량의 기질의 존재, 즉, 4 종의 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들면, 데옥시 티미딘 트리-포스페이트(TTP, 도 2C)의 존재를 필요로 한다. TTP는 도 1에 예시된 경로에 따라 신생으로(de novo) 합성된다. 또한, 포유동물 및 다수의 다른 종들은 G1-S 세포 주기 단계에서만 발현되고 티미딘(T, 도 2A)을 티미딘 모노-포스페이트(TMP, 도 2B)로 인산화하는 것에 의해 대사로 재사용하는 TK를 코딩한다(도 1)(1, 검토). 배양 중인 세포의 DNA로 결합(incorporate)된 방사성 T의 결정이 전통적으로 세포 분열 속도의 척도로서 이용되었다. 1980년대에 건강한 개체 및 다양한 종양 질환을 앓는 환자로부터 유래된 인간 혈장 또는 혈청 내의 TK 활성이 보고되었다(2, 3). 건강한 개체의 경우, 척수액에서 TK 활성의 부재가 관찰되었고, 뇌종양 환자의 경우, 다양한 수준들이 관찰되었다(4). 그 이후, TK 분석은 임상 의학 분야에서, 특히, 상이한 혈액암(blood malignancies)과 연계되어 보다 일반적이 되었다(5-10). TK를 코딩하는 두 개의 세포 유전자가 존재하며, 세포 분열에서 주요한 형태인 TK1은 혈청 내로 s-TK로 분비된다. 이는 종양 질환에서 혈청에서 과다 발현되는 형태이고 본 발명에 따른 분석을 포함한 대부분의 현행의 분석을 이용하여 측정된다. TK2 형은 미토콘트리아에만 존재한다. 미토콘트리아에 국한되는 것 외에, TK2는 또한 TK1과 상이한 기질 스펙트럼 및 동역학적 파라미터를 갖는다(1). 현재까지 상업적으로 이용 가능한 혈청 TK(s-TK) 분석 절차에 포함된 방사성(radioactivity)은 임상 의학에서 그의 보급 및 이용을 제한했다(2). 생체 내에서 종양 세포 분열의 정도와 직접적으로 상관관계를 갖기 때문에, s-TK는 태아 항원(foetal antigen) 또는 분화된 세포에 의해 특이적으로 생성되는 산물의 과다-발현에 의해 종양의 존재를 표시하는 다수의 종양 마커에 대한 보완물(complement)이다. 예를 들면, 전립선 특이 항원(PSA)은 과다량의 전립선 세포의 조기 마커이고, 항원의 수준 증가는 TK 활성 증가보다 오래 전에 검출된다. 그러나, 종양이 탈-분화(de-differentiate)되기 시작하고 보다 빠르게 성장하기 시작하면, PSA 항원(칼리크레인(Kalllikrein) 3)은 사라지고 반면에 증가된 s-TK 활성이 관찰된다(11). 따라서, 치료를 받거나 또는 치료를 받지 않는 환자에서 종양 세포 복제를 모니터링하기 위한 용도 외에, s-TK 활성 및 그 동역학의 변화는 치료적 요법의 변화에 대한 필요성의 측면에서 환자를 선별한다. 환자의 결과(outcome)에서 주어진 s-TK 수준의 중요성은 상이한 종양 종류 간에 다르며 적용된 치료법의 종류, 환자의 연령 및 s-TK 마커를 임상 의학에서 유용한 다변량(multivariate) 모델에 포함되는 중요한 마커로 만드는 다양한 인자들과 연관된다(12). 전술된 바와 같이, 종래 기술에서, TK는 그 활성에 의해서 또는 TK1 단백질(24 kd 유전자 발현 크기)의 물리적 존재를 검출하는 절차에 의해 검출되었다(13). 후자의 절차는 활성 효소 및 비활성 효소를 모두 검출한다. 따라서, 이와 같은 단백질-검출 분석은 s-TK 활성과 상관관계가 낮다. TK1은 세포 주기의 G1기 내지 S기, 즉, 세포 분열 시에만 활성이고, 반면에, TK1 단백질, 또는 그의 분해 생성물은 상이한 반감기를 갖기 때문에, 이는 예상치 못한 현상은 아니다. 따라서, TK 활성을 측정하는 첨단 기술만이 본 명세서에서 다루어질 것이다. 일반적으로, 모든 TK 활성 분석은 포스페이트 공여체(phosphate donor)(예를 들면, 아데노신 트리-포스페이트, ATP) 및 Mg2+(또는 Mn2+)의 존재 하에 분석대상 시료와 T 또는 그의 유사체의 인큐베이션(incubation)으로 구성된다. 그 후, 생성물, 즉, TMP 또는 T-유사체 모노포스페이트의 양은 하기와 같이 결정된다: A) 앞서 기술된 TK 활성 분석에서, 3H-표지된 티미딘(T)을 기질로 이용하였다. TMP는 디-에틸 아미노 에틸(DEAE)-충진된(charged) 여과지에 결합되었고, 상기 여과지는 미사용 T 기질을 제거하기 위해 그 후 세척되었다. 상기 여과지를 건조한 후에, 베타-카운터(beta-counter)로 3H 방사성을 측정하였다. 그러나, s-TK를 세포 증식에 대한 마커로 이용하는 것에 대한 지속적인 관심을 반영하는 방사성 테스트가 여전히 개발되고 있다.(14). B) 상업적으로 이용가능한 Prolifigen®TK-REA(DiaSorin S.p.A. Saluggia, Italy) 분석에서, 방사성 요오도-데옥시 우리딘(125IdU)을 TK에 대한 기질로 이용한다. 모노-인산화 생성물; 요오도-데옥시 우리딘 모노-포스페이트(125IdUMP)는 스스로 침전하는(self-sedimenting) 수산화알루미늄(Al(OH)3)에 결합시키는 것에 의해 분리하고, 뒤이어 미사용 125IdU를 제거하기 위해 수산화 알루미늄을 세척한다. 그 후, 감마-카운터로 Al(OH)3 분말에 결합된 125IdU 방사성을 측정한다 (2, 3). C) 최근에 발표된 비-방사성 TK 분석(15, 16)은 TK 활성을 정량하기 위한 유사한 기술을 개시한다. 이 분석들에서, 아지도-티미딘(AZT, 도 2D) 또는 브로모-데옥시 우리딘(BrdU, 도. 2A)이 기질로서 이용되고, 각각으로부터 형성된 모노포스페이트(AZTMP 또는 BrdUMP, 도 2B)를 제2의 96 웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 웰의 바닥에 고정된 항-AZTMP 또는 항-BrdUMP 항체에 대한 효소-표지된 AZTMP 또는 BrdUMP의 결합과 경쟁하는 반응 용액의 능력을 분석하는 것에 의해 정량하였다(즉, 경쟁적 ELISA에 의한 검출). 방사성을 피하기는 하나, 현재까지 알려진 비-방사성 분석은 낮은 수준의 TK를 포함하는 생물학적 시료를 분석하기에 충분히 효율적으로 보이지 않으며, 이는 분석되는 시료 중에 보다 많은 양의 TK 생성물을 요구하는, 결합된 추적자(tracer)의 감소를 측정하기 때문이다(15, 16). 이는 청년층과 장년층 간에 3배를 초과하는 차이를 가질 수 있는 정상적인 범위에서, 특히, 척수액, 흉수, 복수 및 기타 체액과 같은 측정가능한 기준 수준이 결여된 생물학적 시료에서 TK 분석이 이용되는 경우, TK 활성의 양호한 해상도를 방해한다. 최근에, TMPK, NdK 단독, 또는 TK와 조합된 TMPK, NdK를 보완하는 활성을 이용하는 TMPK, NdK 또는 TK 유전자가 결실된 신규한 재조합 숙주세포주가 개시되었다. 본 발명은 재조합 세포주를 생성하는 방법 및 키나아제 경로에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝하기 위한 세포주를 포함하는 키트에 관한 것이다(17).