식물에서 이형-올리고머 단백질의 생산 document_id A220623053283

식물-기반 분자 농업은 바람직하게는 잠재적으로 낮은 생산 비용과 광우병(Bovine Spongifom Encephalopathy; BSE) 또는 크로이츠펠트 야곱병(Creuzfeld-Jacob Disease; CJD, VCJD)과 같은 인간 병원체에 의한 생산물들의 가능한 오염 때문에 제조방법으로부터 동물-유래 단백질을 제거하기 위한 생물약제학 산업에 의한 시도들 때문에 인간과 동물의 건강 분야에서 사용되는 재조합 단백질의 생산을 위한 흥미를 끄는 기회이다. 그러나 식물 세포에서의 이형-올리고머 단백질의 고-수율 생산은 하기의 이유들 때문에 강한 구조적 또는 조직-특이적 프로모터의 사용에 기반한 표준 발현 시스템에서는 해결될 수 없는 문제이다: 첫째로, 그러한 재조합 단백질들의 대부분은 식물 생장과 발달에 해로운 영향을 주므로, 수율에 강하게 손상을 준다; 둘째로, 조직-특이적 프로모터(예를 들어, 종자-특이적)의 사용은 섭취가능한 농작물(예를 들어, 쌀, 옥수수, 밀)의 게놈에 약제학적 단백질을 암호화하는 유전자의 안정적인 결합을 요구하고, 이것은 개방 농지 경작의 경우에서 외래도입유전자의 이동 조절의 문제를 야기한다. 또한, 상기 시스템들을 생산물의 낮은 수율 때문에 만약 폐쇄(온실) 환경에서 사용되면, 상업적으로 실용가능하지 않다. 식물 바이러스-기반 일시적 발현 시스템들(리뷰를 위해 Porta 0026# Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr.Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94; Gleba et al., 2004, Curr. Opin. Plant Biol., 7, 182-188를 참조하라)은 식물 잎 조직에서 고 발현량을 제공할 수 있고, 생장과 생산 단계의 분리를 가능하게 하는 기술에 의해, 어느 정도까지는 재조합 단백질의 세포 독성과 식물 발달에 대한 그들의 해로운 영향의 문제를 다루는 것이 가능하다. 가장-안정화되고 상업적으로 실용적인 시스템은 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터들, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus; TMV)-유래 벡터들(Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 427-430; Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol. 20, 622-625; US5316931; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO0229068; US5491076)에 기반한다. 그러나 상기 시스템들은 간단하고, 상대적으로 작은 단백질의 생산에 그들의 사용이 제한되는 심각한 제한을 겪는다. 만약, 바이러스 벡터가 1 kb 이상의 이형 서열을 운반한다면, 일부분 이것은 바이러스 벡터의 비안정성과 야생종으로의 그들의 복귀의 고 빈도에 의해 발생한다. 또한, 기술의 심각한 제한점은 재조합 단백질의 가장 유용한 집단을 대표하는 치료용 단일 항체와 이들의 유도체와 같은 복잡한 이형-올리고머 단백질의 발현이 가능한 바이러스 벡터 시스템이 없다는 것이다. 식물 바이러스 벡터를 사용한 식물에서의 전체-길이 단일 항체의 발현을 다루는 문헌은 오직 하나뿐이다(Verch et al., 1998, J. Immunol. Meth., 220, 69-75). 이 논문은 잎 전체에서 단일 항체의 중쇄와 경쇄의 발현을 위한, 두 가지 전신 TMV-기반 바이러스 벡터의 이용을 기술하고, 상기 벡터들의 in vitro 생합성 된 전사체로 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 식물들을 공동-감염함으로써 다른 사슬들은 다른 벡터에서 발현된다. 그러나 상기 시스템에서 재조합 단백질의 수율은 매우 낮아서 조합된 단일 항체의 존재 여부는 웨스턴 블랏팅과 ELISA와 같은 고 감도 테스트로 확인돼야한다. 재조합 단백질의 무시할 만한 수준의 수율 때문에, 상기 시스템은 실용적인 적용에 적당하지 않고, 상업적 가치가 없다. 두 개 또는 그 이상의 TMV-기반 바이러스 벡터는 일반적으로 감염된 식물의 동일한 식물조직에 존재하지 않기 때문에(실시예 1 참조), 검출된 항원 결합 활성은 분리된 세포 또는 조직에서 발현되는 중쇄 및 경쇄 항체로부터 정제 과정 동안 in vitro 조합된 항체에 기인할 것이다. 기능성 항체가 변성되고 환원된 항체 조성물로부터 in vitro 조합될 수 있는 것은 이미 알려져 있다(Petersen 0026# Dorrington, 1974, J. Biol. Chem., 17, 5633-5641; Maeda et al., 1996, Protein Engineering, 9, 95-100). 그러나 상기 조합에 유용한 조건의 결여에서 상기 조합의 효율은 매우 낮다. 그러므로, 곰팡이 또는 곤충 세포 발현 시스템과 같은 다른 대-규모 발현 시스템의 시장과 경쟁하기에 충분한 수율과 효율의 식물에서 재조합 이형-올리고머 단백질을 위한 대-규모 발현 시스템은 없다. 상기 식물 발현은 가능한 하기의 기준을 충실히 이행해야 할 것이다: (i) 가능한 많은 식물 조직과 상기 조직의 많은 세포에서 관심있는 이형-올리고머 단백질의 발현을 포함하는 고 수율; (ii) 식물 생장에서 재조합 단백질 발현의 해로운 영향을 방지하기 위해, 단백질 또는 관심의 생산물의 발현은, 발현이 식물 발달의 원하는 단계에서 시작될 수 있는 것처럼 일시적(또는 변환 가능한) 이어야 한다; (iii) 식물 세포에서 이형-올리고머 단백질의 상이한 서브유닛을 암호화하는 폴리단백질의 최적화된 비율을 제공하여, 상기 서브유닛으로부터 상기 재조합 단백질 조합의 수준에서 재조합 단백질의 고 수율을 지원함. 그러므로, 본 발명의 목적은 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포 배양에서 이형-올리고머 단백질 생산의 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 추가된 목적은 이형-올리고머 단백질 발현이 가능한 고-수율 식물 발현 시스템의 제공이다. 본 발명의 또 다른 목적은 동일한 식물 세포에서 관심있는 하나 이상의 폴리펩티드를 공동-발현하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 본 발명의 목적은 식물, 식물 일부 또는 식물 세포 배양에서 항체를 발현하기 위한 빠르고 고-수율의 방법을 제공하는 것이다.