거울상이성질체 선택적인 효소에 의한 케토 화합물의 환원방법 document_id A220623053615

카르보닐 리덕타제(이명: 알코올 디하이드로게나제, 산화환원 효소)는 각각 카르보닐 화합물의 환원 및 이차 알코올의 산화에 있어 촉매제로서 알려져 있다. 이 효소는 조효소(coenzyme), 예컨대 NAD(P)H를 필요로 한다. 락토바실러스 케퍼(Lactobacillus kefir)로부터 수득한 카르보닐 리덕타제 및 조효소 NADPH를 이용한 케톤의 환원 방법이, 예컨대 US 5,342,767에 개시되어 있다. 광학적으로 활성인 하이드록시 화합물은 약학적으로 활성인 화합물, 방향족 물질, 페로몬, 농업 화합물 및 효소 저해제의 합성에 폭넓게 적용가능한, 매우 쓸모있는 케이론(chiron)이다. 예를 들어, S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르는 HMG-CoA 리덕타제 저해제, D-카르니틴 및 기타의 합성에 있어 중요한 중간체이다. 거울상이성질체 선택적인 효소는, 예컨대 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르를 상응하는 S-4-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로 환원시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 예로, 하기를 참조할 수 있다: 빵 효모 유래의 리덕타제(D-효소-1, D-효소-2, J. Am. Chem. Soc. 107, 2993-2994, 1985); 스포로볼로마이세스 살모니콜러(Sporobolomyces salmonicolor) 유래의 알데하이드 리덕타네 2(Appl. Environ. Microbiol. 65, 5207-5211, 1999); 칸디다 마세도니엔시스(Candida macedoniensis) 유래의 케토판토텐산 에스테르 리덕타제(Arch. Biochem. Biophys. 294, 469-474, 1992); 게오트리컴 칸디듐(Geotrichum candidum) 유래의 리덕타제(Enzyme Mircrob. Technol. 14, 731-738, 1992); 칸디다 마그놀리(Candida magnoliae) 유래의 카르보닐 리덕타제(WO 98/35025); 클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 유래의 카르보닐 리덕타제(JP-A Hei 11-187869); II형 지방산 신테타제의 β-케토아실-아실 캐리어 단백질 리덕타제(JP-A 2000-189170); 피키아 핀란디카(Pichia finlandica) 유래의 (R)-2-옥탄올 디하이드로게나제(EP 1179595 A1); 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유기체 유래의 R-특이적인 이차 알코올 디하이드로게나제(Lactobacillus kefir (US5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1)(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE10119274); Pseudomonas (US 05385833)(Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Aug; 59(4-5):483-7. Epub 2002 Jun 26., J. Org. Chem. 1992, 57, 1532). 슈도모나스, 락토바실러스 및 피키아 핀란디카(EP 1179595 A1) 유래의 효소 이외에는, 공지된 효소들은 일반적으로 이차 알코올을 기질로서 받아들이지 않아, 이차 알코올의 산화를 촉매하지 못한다. 따라서, 산업적인 효소 환원 공정에서, 상기 효소들은 보조인자 NADH 또는 NADPH의 재생을 책임지는 다른 효소와 커플을 이루어야 한다. 이러한 NAD(P)H 재생에 적합한 효소는 포르메이트 디하이드로게나제, 글루코스 디하이드로게나제, 말레이트 디하이드로게나제, 글리세롤 디하이드로게나제 및 알코올 디하이드로게나제가 있으며, 이들은 바람직하기로는 4-할로-3-옥소부티르산 에스테르의 환원을 위한 효소와 함께 발현된다. 예컨대, 칸디다 마그놀리아(Candida magnoliae) 유래의 카르보닐 리덕타제 유전자 뿐만 아니라 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 글루코스 디하이드로게나제 유전자를 동시에 발현하는, 에셔리키아 콜리(Escherichia coli)의 재조합 세포는, 003e#40%(중량)의 기질 농도에서 실현되는 수성/유기 2상 시스템에서 효율적으로 사용가능한 것으로 입증되었다(Appl Microbiol Biotechnol (2001), 55; 590-595, Ann N Y Acad Sci. 1998 Dec 13; 864:87-95). 락토바실랄레스(Lactobacillales)(Lactobacillus minor; DE 10119274) 그룹 유래의 효소를 이용하는 방법은 지금까지는 2-프로판올을 이용한 기질-커플링된 조효소 재생으로 성공적으로 수행되었으며, 불용성 기질의 재생은 수성/유기 2-상 시스템을 채택함으로써 고농도에서 실현되었다(US 5342767, DE10119274). 2-프로판올 또는 2-부탄올 각각을 이용한 기질-커플링된 조효소 재생을 적용하는 경우, 기본적으로 대부분 효소의 2-프로판올 및 2-부탄올에 대한 낮은 허용성이 한계인 것으로 간주되었다. 통상, 명확하게 10% 미만의 2-프로판올 농도가 사용된다. 종래 기술에서는, 효모 유래의 R-특이적인 산화환원 효소와 2-프로판올 및/또는 2-부탄올을 이용한 기질-커플링된 효소 재생을 이용하는 것에 대한 방법은 알려져 있지 않다. 보조기질(cosubstrate) 2-프로판올의 제한적인 사용으로 인해, 만족스럽지 못한 기질 농도 및 변환율이 수득되었다(Angew Chemie Int Ed Engl 2002, 41: 634-637, Biotechnol Bioeng 2004 Apr 5; 86 (1): 55-62). 최근에는, 2-프로판올이 실질적으로 높은 농도 50-80%(부피)인 경우에서도 여전히 안정적이고, 활성형인, 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) 유래의 S-특이적인, 중쇄 알코올 디하이드로게나제의 분리가 가능해졌다(Biotechnol Bioeng 2004 Apr 5; 86 (1): 55-62), WO 03/078615).