허혈성 망막 조직의 혈관재형성 및 이의 스크리닝 방법 document_id A220623053681

당뇨성 망막병증, 삼출성 노화 관련 황반 변성(ARMD), 조숙 망막병증(ROP) 및 혈관 폐색을 포함한 망막의 혈관 질환은 시력 손상 및 실명의 주요 원인이다. 이러한 질환 그룹은, 병리학적 안구 혈관신생을 예방하거나 완화할 새로운 치료 양태를 동정하기 위한 집중적인 연구 대상이다. 예를 들어, ARMD는 65세 이상의 1200만 내지 1500만명의 미국인이 앓고 있고, 이 중 10 내지 15%에 대해서는 맥락막(망막하부) 혈관신생의 직접적인 결과로서 시력 상실을 유발한다. 65세 이하의 미국인에 대한 시력 상실의 주된 원인은 당뇨병이다. 미국에는 1600만명의 당뇨병 환자가 있고, 해마다 4만명이 이 질환의 안구 합병증을 종종 망막 혈관신생의 결과로서 앓고 있다. 레이저 광응고는 고위험 당뇨환자의 서브그룹 중에서 심각한 시력 상실을 예방하는데 효과적이지만, 총 10년간 망막병증의 발생수는 거의 변화가 없는 실정이다. ARMD로 인한 맥락막 혈관신생 환자 또는 안구 히스토플라스마증과 같은 염증성 안구 질환 환자의 경우에는 소수를 제외하고는 광응고가 시력 상실의 예방에 비효과적이었다. 최근 개발된 비파괴적 광선역학요법이 종래 치료불가능했던 맥락막 혈관신생 환자의 개체별 상실을 일시적으로 감소시킨다는 전망이 있었지만, 위약 처리된 그룹의 45.9%에 비해 3 내지 4개월마다 처치된 환자의 61.4%만이 시력이 개선되거나 안정되었다. 노화 관련 황반 변성 및 당뇨성 망막병증은 선진 국가에서 시력 상실의 주된 원인이며, 비정상적인 망막 혈관신생의 결과로서 일어난다. 망막은 명확하게 구분되는 신경세포, 아교세포 및 혈관 요소의 층으로 구성되어 있는 바, 혈관 증식 또는 부종에서 관찰되는 바와 같은 비교적 적은 장애도 시력 기능을 상당히 상실시킬 수 있다. 또한, 색소 망막염(RP)과 같은 유전 망막 변성은 혈관 이상, 예컨대 세동맥 협소화 및 혈관 위축과도 연관되어 있다. 혈관형성을 촉진 및 억제하는 인자를 확인하는 기술이 상당히 진보되었지만, 현재 특정하게 안구 혈관 질환을 치료하는데 이용할 수 있는 치료법은 없다. 망막의 유전적 변성은 3500명 중 1명 정도이고, 진행성 야맹증, 시야 상실, 시각 신경 위축, 세동맥 약화, 혈관 투과성 변경 및 종종 완전 실명으로 발전하는 중추성 시력 상실을 특징으로 나타낸다(Heckenlively, J.R., editor, 1988; Retinitis Pigmentosa, Philadelphia: JB Lippincott Co.). 이러한 질환들의 분자 유전자적 분석은 비교적 적은 백분율의 공지된 환자만을 차지하는 110개의 다른 유전자들에서 돌연변이를 동정했다(Humphries et al., 1992, Science 256: 804-808; Farrar et al. 2002, EMBO J.21: 857-864). 이러한 돌연변이 중 대부분은 로돕신, cGMP 포스포디에스터라제, rds 페리페린 및 RPE65를 포함한 광변환 기구의 효소적 및 구조적 성분과 관련이 있다. 이러한 관찰에도 불구하고, 상기 망막 변성 질환의 진행을 지연 또는 반전시키는 효과적인 치료법은 아직까지 전무하다. 유전자 요법에서의 최근 진보는, 야생형 전이유전자(transgene)가 특정 돌연변이를 보유한 동물의 광수용체 또는 망막색소상피(RPE)로 전달될 때, 마우스에서의 rds(Ali et al., 2000, Nat. Genet. 25: 306-310) 및 rd(Takahashi et al. 1999, J.Virol. 73: 7812-7816) 표현형과 개에서의 RPE65 표현형(Acland et al. 2001, Nat.Genet. 28: 92-95)을 성공적으로 반전시켰다. 혈관형성은 새로운 혈관이 형성되는 과정이다. 특정 화학적 시그널에 대한 반응으로, 모세관은 기존 혈관에서부터 발생하고, 결국 생물체에 의해 요구되는 정도의 크기로 성장한다. 먼저, 혈관 안에 있는 내피 세포가 기존 혈관에 직교 방향으로 분열하여 딱딱한 싹을 형성한다. 그 다음, 인접 내피 세포가 큰 공포(空胞)를 형성하고, 이 공포가 스스로 말단끼리 이어지고 결국은 병합하여 새로운 모세혈관의 내강이 형성되도록(관 형성) 세포가 재배열한다. 혈관형성은 상처에 대한 반응과 같은 다양한 상태에 의하여 자극되고, 포유동물과 같은 척추동물 유기체에서는 사실상 모든 조직의 성장을 동반한다. 또한, 혈관형성은 당뇨 망막병증과 같은 특정 질환 상태 및 특정 암에서 일정한 역할을 하기도 한다. 예를 들어, 종양의 성장은 성장하는 종양 조직에 산소와 영양분을 제공하기 위하여 혈관의 성장을 필요로 한다. 혈관형성은 혈관형성 과정을 자극하는 화학적 시그널을 방해함으로써 정지되거나 억제될 수 있다. 예를 들어, 혈관형성내피세포는 혈관을 둘러싼 기정 층을 분해하여 새로운 모세혈관의 경로를 분명히 하는 프로테아제를 생산한다. 이러한 프로테아제의 억제 또는 이의 형성 억제는 신생 혈관이 형성되지 못하게 할 수 있다. 이와 마찬가지로, 상기 내피세포는 화학적 시그널에 대해 반응하여 증식한다. 특히 중요한 증식 시그널에는 혈관내피성장인자(VEGF) 및 섬유아세포성장인자(FGF) 계열의 단백질이 있다. VEGF는 특정 종양의 혈관신생에 관여한다는 것이 밝혀져 있다. 이러한 증식 시그널링 과정의 방해도 역시 혈관형성을 억제할 수 있다. 혈관형성에는 몇가지 인자가 관여한다. 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자 분자는 내피세포 및 다른 세포 유형에 대한 유사분열물질이다. 혈관내피세포에 대한 고도로 선택적인 유사분열물질은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다. 정상 성인에서 혈관형성은 엄격히 조절되고, 상처 치유, 임신 및 자궁 주기에만 국한된다. 혈관형성은 염기성 및 산성 섬유아세포 성장인자(FGF), VEGF, 안지오제닌, 형질전환성장인자(TGF), 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 혈소판-유래 성장인자(PDGF)와 같은 특정 혈관형성 분자에 의해 개시된다. 혈관형성은 억제성 분자, 예컨대 인터페론-α, 트롬보스폰딘-1, 안지오스타틴 및 엔도스타틴 등에 의해 억제될 수 있다. 이러한 천연의 자극인자와 억제인자의 균형이 보통은 무활동인 모세혈관의 혈관구조를 조절한다. 이러한 균형이 특정 질환 상태에서처럼 깨지면 모세혈관 내피세포는 증식하고 이동하여 결국 분화가 유도된다. 혈관형성은 암 및 안구 혈관신생을 포함한 다양한 질환에서 중추 역할을 한다. 다양한 종양의 지속적인 성장과 전이도 역시 종양 유래 혈관형성 인자에 대한 반응으로 신생 숙주 혈관이 종양으로 성장하는지에 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 다양한 자극에 대한 반응으로 나타나는 신생 혈관의 증식은 대다수의 안구 질환, 예컨대 증식당뇨망막병증, ARMD, 홍조성 녹내장(rubeotic glaucoma), 사이질각막염 및 조숙 망막병증 등에서 주된 결과로 나타난다. 이러한 질환에서, 조직 손상은 모세혈관 증식을 초래하는 혈관형성 인자의 방출을 자극할 수 있다. VEGF는 홍채 혈관신생과 혈관신생 망막병증에서 주된 역할을 한다. 안내 VEGF 농도와 허혈성 망막병증 안구 혈관신생 사이의 상관관계를 분명하게 보여주는 보고가 있지만, FGF도 특정 역할을 하는 것으로 추정된다. 염기성 및 산성 FGF는 검출가능한 농도가 혈관신생과 일정한 상관성은 없지만, 정상 성인의 망막에 존재하는 것으로 알려져 있다. 이것은 주로 FGF가 세포외 기질의 하전된 성분에 매우 강하게 결합해 있고 안내액의 표준 분석을 통해 검출되는, 자유롭게 확산할 수 있는 형태로는 손쉽게 수득할 수 없다는 사실에 기인할 수 있다. 혈관형성 반응의 최종 공통 경로는 증식혈관내피세포와 세포외 기질 사이의 인테그린 매개된 정보 교환을 수반한다. 인테그린이라고 불리는 이러한 부류의 부착 수용체는 모든 세포에서 α 및 β 서브유닛을 보유한 이종이량체로서 발현된다. 이러한 인테그린 중 하나인 αvβ3은 이 계열 중 가장 혼잡한 일원으로, 내피세포를 매우 다양한 세포외 기질 성분과 상호작용할 수 있게 한다. 이러한 인테그린의 펩티드 및 항체 길항제는 증식혈관내피세포의 아폽토시스를 선택적으로 유도하여 혈관형성을 억제한다. 혈관형성의 경로에는 2가지 사이토킨 의존 경로가 존재하고, 이들의 독특한 혈관세포 인테그린인 αvβ3 및 αvβ5에 대한 의존성에 따라 정의될 수 있다. 구체적으로, 염기성 FGF 유도성 및 VEGF 유도성 혈관형성은 인테그린 αvβ3 및 αvβ5에 각각 의존하는데, 그 이유는 각 인테그린의 항체 길항제가 토끼 각막 및 병아리 융모요막(CAM) 모델에서 상기 혈관형성 경로 중 하나를 선택적으로 차단하기 때문이다. 모든 αv 인테그린을 차단하는 펩티드 길항제는 FGF 자극 및 VEGF 자극의 혈관형성을 억제한다. 정상인의 안구 혈관에서는 어떠한 인테그린도 관찰되지 않지만, 활동 혈관신생 안구 질환을 가진 환자에서 유래된 조직에 있는 혈관에서는 αvβ3 및 αvβ5 인테그린이 선택적으로 관찰된다. ARMD 환자 유래의 조직에서는 αvβ3 만이 일정하게 관찰되지만, 증식성 당뇨 망막병증 환자 유래의 조직에서는 αvβ3 및 αvβ5 가 모두 존재하였다. 망막 혈관형성의 마우스 모델에서는 전신 투여한 인테그린의 펩티드 길항제가 새로운 혈관 형성을 차단했다. 망막 혈관신생 질환에 대한 가능성 있는 시험적 치료가 여러 동물 종, 예를 들어 새끼 고양이, 비글 강아지, 래트 및 마우스에서 산소-유도된 망막병증(OIR)의 모델의 개발에 의해 매우 수월해졌다. 이들 각 모델에서, 신생 동물을 고산소압에(또는 고산소압과 저산소압에 교대로) 노출시키면, 망막 혈관 발달의 퇴화 또는 지연을 일으키고, 이어서, 정상 산소 수준으로 회복한 후에도 비정상 혈관형성을 일으킨다. 이들 모델은 조숙 유아에 영향을 줄 수 있는 병리학적 혈관신생을 수반하는 상태인 조숙 망막병증(ROP) 동안에 일어나는 현상을 반영한다. 지난 10년 동안, OIR의 마우스 모델은 산소-유도된 망막병증과 관련된 비정상적 혈관형성을 연구하기 위한 가장 일반적인 모델이 되었다. 이러한 모델에서 혈관 비정상의 패턴은 ROP에서 관찰된 것과 다소 상이하며; 마우스에서, 중심 후방 망막이 고산소압에 노출된 후 무혈관이 된 반면에, 사람 유아에서는 주변부가 무혈관이다. 그럼에도 불구하고, 이는 저산소압-유도된 망막병증의 질환 기전 및 가능성 있는 치료를 연구하기 위한 익히-허용된 모델이며, 혈관 변화는 매우 일관되고, 재현가능하고, 정량가능하다. 최근에, 이러한 모델의 사용이 허혈성 혈관병증 및 관련된 항-혈관형성 시술의 일반적인 연구에까지 확장되었으며, 이제, 이는 기초 및 응용 모두의 연구 환경에서 광범위하게 이용된다. 마우스 OIR 모델에서 증식성 혈관신생 반응을 정량하기 위하여 역사적으로 통상적인 방법은, 망막으로부터 유리체로 이어지는 신생혈관을 수반하는 세포("예비-내경계막(ILM: pre-inner limiting membrane) 핵")의 수를 계수함을 토대로 한다. 이는 시상 횡단면에서, 통상적으로 시신경유두(이외에 다른 것도 포함) 부근의 영역에서 수행된다. 상기 방법은 매우 노동-집약적이고, 시간 소모적이고, 유리체 내의 유리체막 혈관의 세포들로부터 비정상적 혈관의 세포들을 구별할 필요가 있는 등의 어려움이 있다. 일반적으로, 매번 30번째 연속 절편만을 평가하기 때문에, 조직의 많은 부분이 정량되지 않으므로, 잠재적으로 광범위한 샘플링 오류가 도입된다. 추가로, 전체 안구가 즉시 절개되기 때문에, 이는 상기 모델의 또 다른 중요한 매개변수, 즉 비정상적 신생혈관 다발 형성과 동시에 일어나는 망막 혈관재형성의 속도 및 혈관 폐색의 정도의 동일-안구 평가를 방해한다. 상기 매개변수는 전체 망막 표본 제작에서 가장 잘 평가된다. 따라서, 망막 혈관신생 질환을 치료하고 전체 망막에서 이러한 치료의 치료적 효능을 평가하기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 본 발명의 방법은 이들 요구를 충족한다. 발명의 개요 본 발명은 허혈 망막 조직의 생리학적 혈관재형성을 촉진하는 치료 방법을 제공한다. 본 방법은, 트립토파닐-tRNA 신테타제(TrpRS)의 혈관신생억제성 단편의 치료학적 유효량을 망막 허혈을 앓는 포유동물에게 투여함을 포함하여, 망막의 병리학적 혈관신생을 억제하고 동시에 망막의 손상된 영역에서 유리한 생리학적 혈관재형성을 촉진하는 것이다. 바람직한 태양에서, TrpRS의 혈관신생억제성 단편은 T2 단편이다. 바람직하게는, 당해 포유동물은 망막 허혈을 앓는 사람 환자이다. 본 발명의 치료 방법은, 당뇨성 망막병증, 조숙 망막병증 등과 같은 허혈성 망막병증을 포함하는 허혈성 및 혈관신생성 안질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 또 다른 양상은 망막 혈관신생 질환을 치료하기 위한 잠재적 치료제의 치료 효능을 확인하고 평가하는 스크리닝 방법이다. 본 방법은 신생 마우스, 바람직하게는 약 7일령의 마우스를 망막 혈관계의 측정가능한 퇴행을 유도하기에 충분한 기간 동안, 바람직하게는 약 5일 동안 고산소압에 노출시키고, 후속적으로 마우스를 정상 산소압으로 복귀시킴을 포함한다. 정상 산소압으로 복귀시킨 후, 잠재적 치료제를 마우스의 안구에 투여한다. 바람직하게는 정상 산소압으로 복귀시킨지 약 5일 후, 치료된 안구로부터 전체 망막을 분리한다. 동일한 기간 동안 동일한 수준의 고산소압에 노출시킨 동일한 마우스 또는 동일한 연령의 마우스로부터 유래된 대조군 안구로부터 실질적으로 전체 망막을 또한 분리한다. 바람직하게는, 대조군 안구에는 잠재적 치료제 대신 완충제 또는 염수 용액을 투여하였다. 치료된 망막 및 대조군 망막의 혈관을 즉각적인 확인 및 가시화를 위해 염색한다. 고산소압에 의해 야기된 혈관 폐색의 영역 및 정상 산소압으로 복귀시 형성하는 예비-망막 혈관신생 다발의 영역을 가시화하기 위하여, 실질적으로 전부 염색된 망막의 현미경 상을 입수한다. 이어서, 고산소압 상태에 의해 야기된 혈관 폐색의 영역을 평가하고, 정상 산소압으로 복귀시 일어나는 병리학적 혈관신생의 정도를 평가하기 위하여, 현미경 상을 분석하였다. 치료된 안구 대(對) 대조군 안구에서 혈관 폐색의 영역을 비교하고, 치료된 안구 대(對) 대조군 안구에서 예비-망막 신생혈관 다발의 영역을 비교하여, 잠재적 치료제의 효능을 평가한다. 병리학적 혈관신생의 정도는, 대조군 안구에 대한 치료된 안구에서 예비-망막 신생혈관 다발을 나타내는 망막의 영역에 의해 입증된다. 예비-망막 신생혈관 다발의 영역이 감소한다는 것은 혈관신생억제 활성을 가리킨다. 즉, 상기 제제는 병리학적 혈관신생을 억제한다. 혈관재형성의 평가는, 대조군 안구에 대해 치료된 안구에서 혈관 폐색의 영역을 비교하여 수행한다. 치료된 안구 대 대조군 안구에서 혈관 폐색의 영역이 감소한다는 것은, 상기 치료제가 손상된 망막의 유리한 생리학적 혈관재형성을 유도한다는 것을 가리킨다.