세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 추출및 회수하는 방법 document_id A220623053761

재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 사용하고 환경에 공격적이지 않은 방법을 통해 생분해성 및 생체적합성 재료를 생산하기 위한 필요성에 대해서는 현재 전세계 산업분야에 알려져 있다. 현대 사회에서, 플라스틱 재료의 대량 사용은 갈수록 심각한 각종 환경문제를 야기하고 있다. 이러한 문제점들에 비추어, 생분해성 플라스틱 수지, 주로 재생가능한 공급원을 사용하는 청정기술(clean technology)에 의해 생산된 것들의 개발이 전세계적으로 주목받고 있다. 동일한 출원인의 브라질 특허출원 제 PI04005622-1 호(PCT/BR04/000237)의 도입부에 기술된 바와 같이, 시장에서 가장 성공가능성이 있는 이들 생분해성 생체고분자의 적용예로는 일회용 재료, 예를 들면 포장재, 화장품 및 독성 농약의 용기, 및 의약품과 같은 제품이다. 170 가지 이상의 대표종이 문헌에 개시되어 있는데, PHA에 대한 상업적 관심은 생분해성뿐만 아니라 이들의 열적-기계적 성질 및 생산 비용에도 직접 관련되어 있다. 따라서, 일부 PHA만이 공업적 적용이 가능하며, 가장 대표적인 것은 PHB (폴리-3-하이드록시부티레이트), PHB-V (폴리(하이드록시부티레이트-코-하이드록시발레레이트)), P4HB (폴리(4-하이드록시부티레이트)), P3HB-4HB (폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트)) 및 일부 PHAmcl(중쇄 폴리하이드록시알카노에이트)이며, 마지막 부류중 가장 전형적인 대표종은 PHHx (폴리하이드록시헥사노에이트)이다. PHA의 화학 구조는 하기 단위의 반복에 의해 형성된 고분자 사슬로서 설명될 수 있다: 상기 식에서, R은 다양한 길이의 알킬 또는 알케닐 그룹이고, m 및 n은 정수이며, 상기 언급한 중합체에서 R 및 m은 하기 값일 것으로 추정된다: PHB: R=CH3, m=1 PHB-V: R=CH3 또는 CH3-CH2, m=1 P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H 또는 CH3, m=1 또는 2 PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1 지난 20 년 동안의 자연 과학, 특히 생명공학에서의 위대한 발전을 통해, 가장 다양한 천연 또는 유전자 변형 유기체를 PHA의 상업적 생산에 사용할 수 있게 되었다. 본 발명과 특히 관련이 있는 것은 상당한 양의 상기 고분자를 그의 내부에서 생산하고 축적할 수 있는 일정 박테리아 균주를 사용하는 것이다. 높은 세포 밀도, 높은 세포 내 고분자 함량 및 공업적 방법에 적합한 수율에 달성하게 하는 특정 조건하에서 배양된 상기 박테리아 균주는 다양한 재생가능 원료, 예컨대 사탕수수, 당밀 또는 가수분해된 셀룰로오스 추출물을 이용할 수 있다. 미국특허 제 3107172 호에 개시된 바와 같이, (PHA 가용화제를 사용하지 않고) 자연 상태의 박테리아 세포를 성형가능 재료로서 적용하기 위한 시도가 있었으나, 대부분의 경우 PHA의 상업적 적용예는 목적하는 플라스틱 성질을 얻기에 충분히 높은 순도를 요한다. 생체고분자, 특히 PHA를 제조하는데 적합한 수준의 순도에 도달하기 위해서는, 통상 잔류 바이오매스로부터 PHA를 추출 및 회수하는데 용매의 사용이 불가피한 단계가 필요하다. 유럽 특허공개 제 01455233 A2 호에는 효소 및/또는 계면활성제를 사용하여 비-PHA 세포 물질을 가용화함으로써 PHA를 함유하는 세포의 수성 현탁액의 소화를 수행하는 몇몇 가능성이 개시되어 있는데, 용매가 사용되는 경우에 발생할 것 같지 않지만 이 방법에서 효소들은 매우 비싸고 회수될 수 없다는 사실이 고려되어 있다. 또한, 세포 물질을 고농도로 희석시킬 필요가 있는데 이로 인해 공정중에 다량의 폐수가 발생한다. 통상 제시되는 추출 방법은 기본적으로 생체고분자를 함유하는 건조 또는 습한 세포 바이오매스를 상기 고분자를 가용화시키는 용매와 격렬하게 접촉하도록 노출시킨 다음 세포 잔류물(데브리스)을 분리하는 단계로 이루어진다. 이어, 상기 생체고분자를 함유하는 용액에 불용화제를 첨가하여 용매 중에 생체고분자를 침전시킨다(참조예, 1991년 7월 16일에 출원되고 1993년 2월 24일에 공개된 브라질 특허 제 PI 9103116-8 호). 유기 용매를 통한 추출 방법에서, 사용되는 용매는 부분적으로 할로겐화된 탄화수소, 예컨대 클로로포름(미국 특허 제 3275610 호), 메틸렌-에탄올 클로라이드(미국 특허 제 3044942 호), 비점 65 내지 170℃의 클로로에탄 및 클로로프로판, 1,2-디클로로에탄 및 1,2,3-트리클로로프로판(유럽 특허 제 0014490 B1 호 및 유럽 특허 제 2446859 호)이다. 디클로로메탄, 디클로로에탄 및 디클로로프로판과 같은 다른 할로겐화 화합물은 미국 특허 제 4,562,245 호(1985), 제 4,310,684 호(1982), 제 4,705,604 호(1987), 및 유럽 특허 제 036,699 호(1981) 및 독일 특허 제 239,609 호(1986)에 인용되어 있다. 할로겐화 용매를 이용하여 바이오매스로부터 생체고분자를 추출 및 정제하는 방법은 환경 및 인체 건강에 매우 공격적이기 때문에 지금은 완전히 금지되고 있다. 따라서, 세포 바이오매스로부터 생체고분자의 잠재적 추출제(potential extractor)로서 사용될 수 있는 용매는 우선 환경에 대해 공격적이지 않아야 한다는 조건을 만족시켜야 한다. 이러한 관점에서, 브라질 특허 제 PI 9302312-0 호(1993년에 출원되고 2002년 4월 30일에 허여됨)는 용매로서 3 개의 탄소를 가진 장쇄 알콜 또는 이로부터 유도된 아세테이트를 이용하여 박테리아 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하는 방법을 제시하고 있다. 본 특허는 이소아밀 알콜 (3-메틸-1-부탄올), 아밀 아세테이트 (또는 아밀-아세트산 에스테르), 및 알콜 발효의 부산물로서 수득되는 고급 알코올의 혼합물이자 이소아밀 알콜을 주성분으로 하는 퓨젤유(fusel oil)를 취하였다. 본 특허는 또한 불용화제 또는 역용매(counter-solvent) 및/또는 한계적 비용매(marginal non-solvent)를 이용할 필요없이 단일 용매를 추출제(extractor) 및 정제제(purifier)로서 사용하는 것을 특징으로 한다. PHA 용액의 용질(생체고분자)의 침전은 용액의 냉각을 통해 수행된다. 미국 특허 제 6,043,063 호(1998년 4월 14일에 출원되고 2000년 3월 28일에 허여됨), 미국 특허 제 6,087,471 호(1998년 4월 14일에 출원되고 2000년 6월 11일에 허여됨), 및 국제 특허출원공개 WO-98/46783 호(1997년 4월 15일에 출원됨)에는 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하기 위한 용매로서 사용가능한 비-할로겐화 용매의 방대한 목록이 개시되어 있으나, 이들 중 다수는 고가일 뿐 아니라 까다로운 공업적 취급성, 독성과 같은 특징을 가지고 있다. 상기 방대한 목록에는 브라질 특허 제 PI 9302312-0 호에 언급된 용매도 포함되는데, 생체고분자와의 비적합성 또는 독성, 폭발성 및 고비용으로 인해 박테리아 또는 식물성 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하기 위해서는 적은 수의 용매만이 공업적으로 사용가능하다. 생체고분자는 열에 민감하므로, 즉 일정치 이상의 온도에 처하면 비가역적으로 분해되고 분자량이 감소하여 상기 고분자에 열가소성 특성을 부여하는 성질에 결정적으로 영향을 미치게 되므로, 공업적으로 사용가능한 용매의 목록은 보다 더 제한됨을 반드시 염두에 두어야 한다. 생체고분자의 분자량을 크게 변화시키지 않으면서도 생체고분자를 추출가능케 하는 적합한 방법과 결합될 경우, 생체고분자의 추출을 촉진하기 위해 선택된 용매의 공업적 이용가능성은 더욱 증가할 것이다. 다양한 적용예에서 10,000 내지 50,000의 저분자량을 가진 PHA가 사용되지만, 더 큰 범위의 상업적 적용예에서 바람직한 분자량은 500,000 Da 이상이다. 가능한 한 최초 분자량, 즉 PHA가 세포 내에 존재할 경우의 분자량에 가까운 분자량을 가진 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 제조하기 위해서는, 생체고분자를 가용화시키기 위해 PHA 용매를 70℃ 이상으로 가열시켜야 하는 경우를 고려하는 것이 중요하며; 동일 출원인의 상기 제 PI04005622-1 호(PCT/BR04/000237)에 언급된 이전 특허 출원에 논의된 바와 같이, 공정동안 생체고분자가 상기 온도에 노출되는 시간이 길수록 생체고분자가 더 많이 분해되어 그의 열가소성 성질을 회복할 수 없게 악화시킬 수 있다. 예를 들어, 최초로 1,000,000Da의 분자량를 가진 폴리하이드록시부티레이트를 110℃ 이소아밀 알콜에서 추출시키면 노출시간이 5분인 경우 951,230 Da; 노출시간이 15분인 경우 853,692 Da; 노출시간이 30분인 경우 707,410 Da; 노출시간이 60분인 경우 414,771 Da; 및 노출시간이 90분인 경우 122,230 Da이 수득되었을 것이다. 우수한 기계적 성질을 가진 순수한 생성물을 수득하기 위해서는 추출 이외에 용매의 증발 및 건조와 같은 다른 조작이 필요하다는 점과 이들 조작으로 인해 생체고분자가 물질과 관련한 중대한 상태에 다수 노출되는 점을 고려할 경우, 이러한 형태의 물질을 처리하는데 있어서의 고유 난점을 생각하는 것은 어렵지 않다. 용매 이외에, 생성물을 열적으로 분해하지 않는 적절한 방법을 가지는 것이 바람직하다. 생체고분자의 열 감수성을 고려하고 고분자량 물질을 제조하기 위해서는, 추출 및 회수하는 공정동안 생체고분자의 열분해 수준을 규정하게 되는 고온에 생체고분자가 노출되는 시간이 예를 들어 미국특허 제 6,043,063 호에 언급된 용매의 공업적 이용가능성과 직접적으로 관련이 있음을 고려해야한다. 인용된 특허의 경우, 수득되는 물질의 성질, 특히 생성물의 분자량과 관련된 성질에 대해서는 언급되어 있지 않다. 이러한 형태의 PHA 추출의 공업적인 실행가능성과 관련하여 다른 관련이 있는 사실은, PHA 추출이 강한 에너지 소비의 공정이므로 생성물의 생존능이 또한 값이 싼 재생가능 에너지 공급원의 이용가능성과 직접적으로 관련이 있다는 것이다. 위에 제시된 사실을 고려할 경우, PHA를 제조하는 공업적 방법은 단순하고 효율적인 생산 프로토콜을 가지며 원료가 폴리머로 전환시 높은 효율을 나타내는 유기체의 스트레인; 저비용 및 고수율의 원료; 높은 수율 및 효율을 가지며 환경에 공격적이지 않은 방법을 통해 고순도의 생성물을 수득하고 생체고분자의 고유 특징을 최대로 보존하게 하는 폴리머의 추출 및 정제하는 방법을 고려하여야 한다는 것으로 결론짓는 것이 가능하다. 이러한 경제적인 측면 이외에, 그것은 더욱 환경친화적인 생성물이므로 그의 전체 공정은 친화적(compatible)이어야 한다. 즉, 임의의 생산 단계에 환경적으로 유해한 제품을 사용하지 말아야 한다. 또한, 생산 공정을 가동하는데 사용되는 에너지 공급원은 재생가능 공급원이어야 한다. 예를 들어 재생불가능한 에너지 공급원만을 사용하여 환경을 덜 파괴하는 플라스틱을 생산한다는 것은 이치에 맞지 않을 것이다. 알콜 발효의 부산물로서 수득되는 천연 용매 및 설탕과 당밀과 같은 값이 싼 원료의 입수가능성과 함께 재생가능하고 값이 싼 에너지는 설탕 및 알콜 산업을 바이오플라스틱 생산의 이상적인 거점이 되게 한다. 저가의 원료로부터 고순도 및 고분자량을 가진 PHA를 효율적을 수득할 목적으로, 동일 출원인의 이전 특허출원 제 PI04005622-1 호(PCT/BR04/000237)에는 비-할로겐화 용매를 사용함으로써 환경에 공격적이지 않는 특징을 나타내며 발효에 의해 수득된 박테리아 세포 바이오매스로부터 PHA를 회수하는 방법이 제시되어 있다. 본 방법을 수행하기 위한 용매의 적합성을 고려하면, 용매 및 PHA가 용해된 현탁액을 생성하기 위해, 후자는 건조 세포물질의 함량이 약 18 중량% 이상인 수성 현탁액 중의 세포 바이오매스 슬러리를 원료 물질로서 사용하는데, 여기서 슬러리는 용매로 되고 반응기 내에서 교반 및 가열된 다음, 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로부터 여전히 뜨거운 상태로 분리된다. 이어, PHA와 용매의 용액을 PHA를 침전시키는 온도로 냉각시킨 다음 미세-여과하여 약 5% 이상의 PHA 농도를 가진 PHA 페이스트를 수득하고, 이 페이스트를 가열하고 수증기의 주입에 의해 다시 교반하여 용매를 제거하고 PHA 과립의 수성 현탁액을 형성한 다음 최종적으로 분리 처리한다. 상술한 이전 방법에서 제시돤 용매를 사용하면, 용매 중 용해된 PHA의 농도는 5% 이하여서, 현탁액중의 PHA 농도를 경제적 실행가능성의 측면에서 공정을 지속가능하게 하는 최소치에 도달하도록 하기 위해서는 미세-여과 공정을 필요로 한다. 생체고분자의 분자량을 보존하기 위해서, 용액은 미세-여과 이전에 신속하게 냉각된다. 따라서, 최초로 가열된 큰 부피의 희석 현탁액이 용매 증발 이전에 냉각된 다음 재-가열되기 때문에, 이전 방법은 비교적 많은 양의 에너지를 요한다. 또한, 상기 방법은 신속한 냉각 및 미세-여과 단계를 수행하는데 필요한 고가의 장비가 제공된 설비를 필요로 한다. 언급된 용매에 대한 PHA의 낮은 용해도를 고려하면, 본 방법에 필요한 순환 용매의 부피가 크기 때문에 용매 증발을 위해서는 펌프 장비 및 더 큰 장비가 요구되며, 이를 작동하기 위해서는 더 큰 전기적 및 열적 에너지가 요구된다. EP 0479043A1은 미생물에 의해 세포 내에서 합성된 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 방법을 개시하는데, 이 방법은 발효 용액 또는 발효 용액 중에 함유되는 물의 적어도 일부를 세포 현탁액으로부터 제거하는 단계, 세포 재료에 물을 첨거하거나 첨가하지 않고, 물과 혼합하지 않으며 100℃ 미만의 끓는 점을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트용 유기 용매로 처리하는 단계, 형성되는 추출 혼합물을 실온으로부터 유기 용매의 끓는 점까지의 온도에서 교반하고 원심 분리하거나 원심 분리하지 않고 침강시켜 수성상 및 유기상을 형성하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 용해시킨 형태로 함유하는 유기상을, 세포 잔기를 용해되지 않은 형태로 함유하는 수성상으로부터 분리하는 단계를 포함하고, 유기상을 유기 용매의 끓는 점보다도 높은 온도에서 뜨거운 물에 주입하여 유기 용매를 증발시키고 폴리하이드록시알카노에이트를 물속에서 침전시켜 후자가 통상적인 방법으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 적절한 용매들로서는, 메틸렌 클로라이드, 클로로폼, 및 트리클로 에틸렌과 같은 할로겐화 탄화수소가 개시되어 있다. 2001년 10월의 Nonato R.V. 등에 의한 제목이 "Integrated production of biodegradable plastic, sugar and ethanol"인 APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY의 vol. 57, no. 1-2의 페이지 1 내지 5에는, 폴리 3-하이드록시부틸산(PHB)과 관련된 공중합체들이 사탕수수 밀(mill)에 통합될 때 유리하게 생산될 수 있다는 것을 기재하고 있다. 생산 공정에 필수적인 에너지는 바이오매스에 의해 제공되고, 환경으로의 이산화탄소의 방출은 사탕수수 작물에 의한 광합성 작용으로 동화되고, 쓰레기(waste)는 수수밭으로 재활용되며, 중합체는 저비용의 탄소원 및 에너지의 이용 가능성을 고려하여 낮은 비용으로 생산될 수 있다. 발명의 요약 상기로부터, 본 발명의 일반적인 목적은 환경에 공격적이지 않은 비-할로겐화 용매를 사용하여 발효를 통해 수득된 박테리아 세포 바이오매스로부터 PHA를 회수하는 방법을 제공함으로써, 비교적 간단한 설비 및 저에너지 소비에 의해 재생가능한 원료 및 에너지를 사용하여 고순도 및 고분자량의 생성물을 생산하는 것이다. 본 발명에 따르면, 본 방법은 이하의 단계를 포함한다: i) 세포 바이오매스를 PHA 용매의 주입, 격렬한 교반 및 반응기 내부에서 신속한 가열의 동시 조작으로 처리하여, 바이오매스 세포 벽의 파괴와 세포 바이오매스에 함유된 PHA의 용해를 유발하고, 현탁액의 중량에 대하여 적어도 2%, 바람직하게는 5% 이상의 농도로 용해된 PHA에 의해 농후해진 PHA 용매 및 세포 바이오매스의 불용성 잔류물(데브리스)을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계; ⅱ) 반응기 내에 형성된 상기 현탁액을 분리 단계로 처리하여 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로부터 용해된 PHA에 의해 농후해진 용매를 회수하는 단계; ⅲ) PHA가 농후한 PHA 용매의 용액을 교반 조작, 및 증발을 통한 실질적으로 모든 PHA 용매의 제거 및 PHA 침전을 유발하기에 충분하고 적당한 온도에서 물 및/또는 스팀으로 세척 조작으로 처리하여, 물 및 잔존하는 용매에 침전된 PHA를 포함하는 현탁액을 형성하는 단계; ⅳ) 잔존하는 용매가 소모될 때까지 상기 PHA 현탁액에 스팀을 주입함으로써 상기 침전된 PHA의 현탁액으로부터 잔존 용매를 증발 처리하여 수성 현탁액중 정제된 PHA의 입자를 수득하는 단계; ⅴ) PHA 용매가 소모된 수성 매질중의 현탁액을 약 45℃ 이하로 냉각하여 상기 현탁액으로부터 PHA 입자를 분리하는 단계; 및 ⅵ) 분리한 PHA 입자를 건조 단계로 처리하는 단계. 발효 세포 바이오매스로부터 PHA를 추출하기 위해서, 본 명세서에 제시된 방법은 하기 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 용매를 사용한다: 그룹 1: 메틸 포르미에이트, 에틸 포르미에이트, 프로필 포르미에이트, 부틸 포르미에이트, 이소아밀 포르미에이트, 펜틸 포르미에이트 및 카프로일 포르미에이트 (또는 헥실 포르미에이트); 그룹 2: 이소프로필 프로피오네이트, 이소아밀 프로피오네이트, 카프로일 프로피오네이트 (또는 헥실 프로피오네이트); 그룹 3: 메틸 부티레이트, 프로필 부티레이트, 이소프로필 부티레이트, 이소아밀 부티레이트, 펜틸 부티레이트 (아밀 부티레이트), 카프로일 부티레이트 (또는 헥실 부티레이트); 그룹 4: 메틸 이소부티레이트, 에틸 이소부티레이트, 부틸 이소부티레이트, 프로필 이소부티레이트, 이소프로필 이소부티레이트, 이소아밀 이소부티레이트, 펜틸 이소부티레이트 (아밀 이소부티레이트), 카프로일 이소부티레이트; 그룹 5: 프로필 발레레이트, 이소프로필 발레레이트, 부틸 발레레이트, 이소부틸 발레레이트, 이소아밀 발레레이트 (3-메틸-1-부틸의 발레레이트), 펜틸 발레레이트 (아밀 발레레이트) 및 카프로일 발레레이트 (또는 헥실); 및 그룹 6: 메틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (메틸-3-메틸 부타노에이트), 에틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (에틸 3-메틸부타노에이트), 프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소프로필 3-메틸 부타노에이트), 이소프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸-1-이소프로필 부타노에이트), 부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸부틸 3-메틸 부타노에이트), 펜틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (아밀) (펜틸-3 메틸 부타노에이트) 및 카프로일 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (헥실 3-메틸 부타노에이트). 기술된 방법은 비교적 간단하며, 사탕수수로부터의 알콜 및 설탕의 생산과 연관이 있으므로 환경 및 인체 건강에 친화적인 재생가능 에너지 및 원료의 공급원을 이용하고, 대량의 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 추출 및 회수하는 경제적 대안법을 정의한다.