문맥 (context)
셀룰로스는 지구상에서 가장 풍부한 재생 가능 자원이다. 이 셀룰로스는 셀로바이오스(도 5에 나타낸 바와 같은 구조를 가지는 글루코스 이량체)라는 반복 단위를 가지는 β-1,4 글루코스 단위의 선형 사슬로 이루어져 있다. 상기 중합체는 셀룰로스계 중합체를 랜덤하게 가수분해하는 엔도글루카나제(EG), 그리고 셀룰로스로부터 말단 셀로바이오스 잔기를 제거하는 셀로바이오하이드롤라제(CBH)를 포함하는 일군의 효소에 의해 분해된다. 셀로바이오스 및 셀로-올리고당은 β-글루코시다제(BG)에 의해 글루코스로 가수분해된다. 상기 3가지 효소들 모두는 셀룰로스를 글루코스로 완전히 분해하는데에 필요한 효소이다. 상기 3가지 효소들은 각각 기능은 동일하나 구조가 상이한 변이체 관계이다. 뿐만 아니라, 진균 및 박테리아는 상이한 구조적 변이체 이외에도, 동일한 구조적 변이체를 다양한 형태로 생산해 내는 것으로 알려져 있다.
또한, 이 시스템을 종합해보면, 일부 혐기성 박테리아 및 진균은 상기와 같은 효소들을 다수의 효소 복합체 즉, 다수의 효소들이 분자량 2백만 달톤 이상인 효소 골격에 모두 결합되어 있는 복합체의 형태로서 생산하는 것을 알 수 있다. 그렇다면, 단순한 형태의 분자를 생산하는데에 이러한 효소 복합체 시스템이 필요한 이유는 무엇일까? 일부 연구자들은 이와 같이 복잡한 성질은 기질의 저항성으로 인한 것이라고 생각하고 있다. 셀룰로스 사슬은 인접 사슬 간 수소 결합에 의해 결정질의 매트릭스로 팩킹되는 미세 섬유를 형성한다. 이러한 구조는 화학 분해 또는 효소 분해에 대해 매우 저항성이다.
CBH는 이것의 셀룰로스에 대한 효소 공격 특성으로 인하여, 이와 같은 결정질 셀룰로스의 분해에 중요한 역할을 가지는 효소인 것으로 생각된다. CBH와는 달리, EG는 90°로 셀룰로스 사슬을 공격하는 개방형 틈(open cleft)을 가진다. CBH는 활성 부위를 포함하는 터널을 통해 직접 사슬을 공격한다. 현재, 학자들은 셀룰로스 사슬이 상기 터널에 들어감과 동시에, 인접한 수소 결합이 파괴되는 것으로 추측하고 있다. 일단 셀로바이오하이드롤라제가 이와 같이 기질 상에서 "발판(foothold)"을 마련하면, 이후 상기 EG는 기질과 결합하고, 보다 용이하게 이 기질을 공격할 수 있게 된다.
공지의 CBH에 있어서 관찰되는 가장 큰 결점은 촉매 활성이 낮다는 점이다. 일부 학자들은 이와 같이 낮은 활성은, 가수분해로 인한 에너지가 역학적 에너지로 바뀌어 수소 결합이 파괴되고, 이에 따라서 이 효소가 기질을 따라서 이동할 수 있게 된다는 사실로부터 기인한 것이라고 주장하고 있다. CBH는 엑소-작용성(exo-acting) 효소로서, 글리코실 가수분해 효소의 90개 군 중 6개 군에서 발견되는 것이다. 이 CBH는 제5군, 제6군, 제7군, 제9군, 제10군 및 제48군을 포함한다. 상기 제5군은 다수의 상이한 형태의 글리코실 가수분해 효소 예를 들어, 셀룰라제, 만난아제 및 자일라제를 포함한다. 이 군에 속하는 대부분의 셀룰라제는 엔도글루카나제이지만, 주로 클로스트리듐 서모셀륨(Clostridium thermocellum)으로부터 유래하는, CelO와 같은 셀로바이오하이드롤라제도 존재한다. 제6군은 엔도글루카나제 또는 셀로바이오하이드롤라제만을 포함하는데, 이 군은 엔도글루카나제보다는 셀로바이오하이드롤라제 일원을 더욱 많이 포함한다. 상기 효소들은 반전 기작을 가지며, 결정학적 분석 결과 이 효소는 8개가 아닌, 7개의 평행 β-사슬을 포함하는 왜곡된 α/β 원통 모양의 구조를 가지는 것으로 밝혀졌다. 제7군 효소는 또한 엔도글루카나제와 셀로바이오하이드롤라제 이 두 가지로 이루어져 있으며(셀로바이오하이드롤라제가 더욱 많음), 유일하게 공지된 일원은 진균으로부터 유래하는 것이다. 상기 효소는 보유 기작을 가지며, 결정 구조는 β-젤리롤 구조를 가진다고 한다. 제9군은 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 및 β-글루코시다제를 포함하는데, 이 군은 엔도글루카나제를 많이 포함한다. 그러나, 서모비피다 푸스카(Thermobifida fusca)는 엔도/엑소-1,4-글루카나제를 생산하는데, 이것의 결정 구조는 (α/α)6 원통 구조로 폴딩되어 있다고 한다. 이 효소는 엔도- 및 엑소-글루카나제 CBH 둘 다의 특성을 가진다. 제10군은 2개의 일원들 즉, 주를 이루는 셀로바이오하이드롤라제 하나와, 나머지 자일라나제 만을 포함한다. 제10군에 속하는 셀로바이오하이드롤라제 및 자일라나제는 메틸-움베리페릴 셀로바이오시드에 대해 활성을 가진다. 제48군은 주로 박테리아 및 혐기성 진균 셀로바이오하이드롤라제 및 엔도글루카나제를 포함한다. 이것의 구조는 제9군과 유사하게 (α/α)6 원통 구조로 폴딩되어 있다.
저렴하고 재생 가능한 차량용 연료의 공급원이 필요한 시대이다. 새로운 연료 공급원은 그것이 연소된 후 무해한 최종 생성물이 생성된다면 금상첨화일 것이다. 에탄올은 석유를 주원료로 하는 연료에 대한 매력적인 대안이 되며, 전분이나 리그노셀룰로스로부터 유래하는 단당류를 발효시킴으로써 얻을 수 있다. 그러나, 에탄올을 생산하는데에는 비용이 많이 들기 때문에, 현재의 경제 사정으로는 이 에탄올 연료를 보편적으로 사용할 수 없다. 비용을 낮추는 것에 초점을 맞춘 연구의 한 분야는 리그노셀룰로스로부터 발효성 당을 생산하는데에 사용할 수 있는 효소의 기술적 효율을 극대화시키는 것이다. 공급 원료를 보다 효율적으로 분해하는 효소의 개발을 통하여, 에탄올 생산 비용을 줄일 수 있을 것으로 생각된다. 보다 효율적인 공정에 의해서도, 미국이 수입 원유에 의존하는 정도와 이러한 의존성과 관련이 있을 수 있는 가격 변동률을 낮출 것이다. 뿐만 아니라, 바이오에탄올과 같은 운송용 청정 연료를 사용하면 지구 온난화에 일부 책임이 있는 것으로 생각되는 CO2 방출량도 전체적으로 줄일 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 및/또는 β-글루코시다제(베타-글루코시다제), 그리고 이들을 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 효소는 촉매 반응 속도가 증가하여, 기질의 가수분해 과정을 개선시킬 수 있다. 이와 같이 촉매 반응 속도의 효율이 증가하면, 산업 분야에서 유용할 수 있는 당을 생산함에 있어서 효율이 증가하게 되는데, 예를 들어, 이렇게 생산된 당은 에탄올을 생산하는 미생물에 의해 사용될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 활성이 높은(예를 들어, 촉매 반응 속도가 증가한) 셀로바이오하이드롤라제, 엔도글루카나제 및 베타-글루코시다제를 제공한다. 본 발명은 효소 비용을 낮춘(예를 들어, 바이오매스(biomass)를 에탄올 공정으로 도입시키는데 드는 비용을 낮춘) 본 발명의 효소를 사용하는 산업 분야에서의 용도(예를 들어, 바이오매스에서 에탄올로 전환시키는 산업 분야에서의 용도)를 제공한다. 그러므로, 본 발명은 임의의 바이오매스로부터 유래하는 바이오에탄올을 포함하는 연료를 비롯한, 바이오에탄-포함 조성물올 및 바이오에탄올을 생산하는 효율적인 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 효소는 글루카나제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성 예를 들어, 내부 엔도-β-1,4- 및/또는 β-1,3-글루카나제 결합의 가수분해를 촉진하는 활성을 가진다. 하나의 측면에서, 엔도글루카나제 활성(예를 들어, 엔도-1,4-베타-D-글루칸 4-글루카노 하이드롤라제 활성)은, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카복시 메틸 셀룰로스 및 하이드록시 에틸 셀룰로스) 리헤닌의 1,4- 및/또는 β-1,3-베타-D-글루코시드 결합, 혼합형 베타-1,3 글루칸 예를 들어, 곡류의 베타-D-글루칸 또는 자일로글루칸과, 셀룰로스 부분을 함유하는 기타 식물 물질에 존재하는 베타-1,4 결합의 가수분해를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 효소는 엔도글루카나제(예를 들어, 엔도-베타-1,4-글루카나제, EC 3.2.1.4; 엔도-베타-1,3(1)-글루카나제, EC 3.2.1.6; 엔도-베타-1,3-글루카나제, EC 3.2.1.39) 활성을 보유하며, 셀룰로스 및 글루칸 내에 존재하는 내부 β-1,4- 및/또는 β-1,3-글루코시드 결합을 가수분해하여, 보다 작은 분자량의 글루코스 및 글루코스 올리고머를 생산할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 효소를 사용하여 보다 작은 분자량의 글루코스 및 글루코스 올리고머를 생산하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 효소는 글루칸 예를 들어, 1,4-β- 및/또는 1,3-글리코시드 결합 D-글루코피라노스로부터 형성된 다당류를 생산하는데에 사용된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 엔도글루카나제는 식품 산업 예를 들어, 제빵 산업, 과일 및 야채의 가공 과정, 농업용 폐기물을 분해하는 과정, 동물의 사료를 제조하는 경우, 펄프 생산 및 제지, 직물 제조, 그리고 가정용 및 산업용 세정제의 생산에 사용된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 미생물 예를 들어, 진균 및/또는 박테리아에 의해 생산된다.
하나의 측면에서, 본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 곡류의 주요 비-전분 다당류인 베타-글루칸(β-글루칸)을 가수분해하는데에 사용된다. 다당류의 글루칸 함량은 주로 다양성과 성장 조건에 따라서 다양할 수 있다. 이러한 다당류의 생리 화학적 특성으로 인하여, 산화 조건 하에서 점성의 용액 또는 겔로 만들어 질 수 있다. 뿐만 아니라, 글루칸은 물과 결합하는 특성이 매우 강하다. 이와 같은 특성들 모두는 몇몇 산업 분야 예를 들어, 양조, 제빵 및 동물의 영양학 분야에서 단점으로 작용하고 있다. 양조 분야에 있어서, 글루칸이 존재하면, 맥아즙 여과 능이 불량해지고 헤이즈(haze)가 형성된다는 문제점이 있다. 제빵 분야(특히, 쿠키 및 크래커 제조)에 있어서는, 글루칸이 존재하면 반죽에 끈기가 생겨, 기계로 다루기 어려워지고 비스킷 크기도 작아질 수 없게 된다. 그러므로, 본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제를 사용하여 β-글루칸 포함 조성물 내 β-글루칸의 양을 줄일 수 있는데, 예를 들어, 본 발명의 효소를 용액 또는 겔의 점성을 줄이는 공정; 조성물 예를 들어, β-글루칸-포함 조성물이 물과 결합하는 능력을 줄이는 공정; 그리고 양조 분야에 있어서는, (예를 들어, 맥아즙 여과능을 증가시키고 헤이즈 형성을 감소시키기 위해서) 반죽 예를 들어, 쿠키, 빵 및 비스킷 등의 제조용 반죽의 끈기를 감소시키는 공정에 사용할 수 있다.
뿐만 아니라, 탄수화물(예를 들어, β-글루칸)은 제과 제품을 빠른 속도로 재수화시켜 바삭함을 상실시킬 뿐만 아니라, 유통 기한도 감소시키는 것과 관련되어 있다. 그러므로, 본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 바삭함을 유지시키거나, 이를 증가시키거나, 또는 이 바삭함이 없어지는 속도를 늦출 뿐만 아니라, 임의의 탄수화물-함유 식품, 사료 또는 음료 예를 들어, β-글루칸-포함 식품, 사료 또는 음료의 유통 기한을 증가시키는데에 사용된다.
본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 장 내용물(예를 들어, 동물의 경우에는 반추 동물 또는 인간의 장 내용물) 예를 들어, 곡류 식을 포함하는 내용물의 점성을 감소시키는데에 사용된다. 그러므로, 대안적 측면에서, 본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 식품 또는 사료의 소화 능력과, 동물(예를 들어, 인간 또는 가축)의 성장 속도에 긍정적인 영향을 미치는데에 사용되고, 하나의 측면에서는, 사료 전환 효율을 더욱 높이는데에 사용된다. 곡류 식을 이용하는 단위 동물(monogastric animal)의 사료에 있어서, 베타-글루칸은 장 내용물의 점성에 영향을 미치는 요인이므로, 사료의 소화 능력과 동물의 성장 속도에 악영향을 미치게 된다. 반추 동물에 있어서, 베타-글루칸은 섬유 섭취물의 실질적인 성분으로서, 글루칸이 보다 완전히 소화되면, 사료의 전환 효율을 보다 높이는데에 기여할 것이다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 엔도글루카나제를 포함하는 동물 사료 및 식품을 제공하고, 하나의 측면에서, 이 효소는 동물의 소화관 예를 들어, 위 및/또는 소장 내에서 활성을 갖는다.
본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 셀룰로스 또는 임의의 베타-1,4-결합 글루칸-포함 합성 또는 천연 물질 예를 들어, 임의의 식물 물질에서 발견되는 물질을 분해하는데에 사용된다. 본 발명의 효소 예를 들어, 엔도글루카나제는 예를 들어, 목재 가공, 펄프 및/또는 제지 산업, 직물 제조, 그리고 가정용 및 산업용 세정제, 및/또는 바이오매스 폐기물 처리에 있어서 셀룰로스를 분해하는 산업용 효소로서 사용된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 효소, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물, 식품, 사료, 약품, 식품 보조제)을 제공하는 것이다. 이러한 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 정제, 겔, 환제, 임플란트, 액체, 스프레이, 분말, 식품, 사료 펠릿 또는 캡슐화된 임의의 형태의 것으로서 제형화될 수 있다.
본 발명은 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500개 이상의 잔기로 이루어진 부위에 걸쳐서, 본 발명의 대표적인 핵산 예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163 및 서열 번호 165와의 서열 동일성이 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이거나 완벽한(100%) 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 핵산을 제공하고[이하, 표 1a 및 1b, 2 및 3과, 실시예 1 및 4, 그리고 서열 목록 참조]; 대안적인 측면에서, 이러한 핵산은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하고, 또는 상기 핵산은 셀룰라제 암호화 핵산을 동정 또는 분리하는데에 있어서 프로브로서 사용될 수 있거나, 또는 셀룰라제-발현 핵산의 발현을 억제하는데에 사용될 수 있다[상기 모든 측면들은 "본 발명의 핵산"에 관한 것임]. 하나의 측면에서, 상기 서열의 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석법이나 또는 시각적 조사에 의해 결정된다.
본 발명의 핵산은 또한 본 발명의 대표적인 효소, 예를 들어 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164 및 서열 번호 166에 제시된 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산을 포함한다[이하의 표 1a∼1c, 2 및 3과, 실시예 1 및 4, 그리고 서열 목록과 이 서열 목록에 제시된 부분 서열, 그리고 이의 변이체 참조]. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 셀룰라제 활성, 예를 들어 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 혼합 배양액으로부터 유래하는 핵산이라는 점에서 공통적인 신규성을 가지는 셀룰라제 암호화 핵산 예를 들어, 엔도글루카나제-암호화 핵산, 셀로바이오하이드롤라제-암호화 핵산 및/또는 베타-글루코시다제-암호화 핵산을 제공한다. 본 발명은 적어도 약 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 또는 1150개 이상의 잔기로 이루어진 부위에 걸쳐서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 본 발명의 대표적인 핵산 예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163 및 서열 번호 165와의 서열 동일성이 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이거나 완벽한(100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 혼합 배양액으로부터 분리된 셀룰로스-분해 효소-암호화 핵산을 제공한다[이하, 표 1a∼1c, 2 및 3과, 실시예 1 및 4, 그리고 서열 목록 참조].
하나의 측면에서, 본 발명은 공통된 공급원, 예를 들어 환경적 공급원으로부터 유래한다는 점에서 공통된 신규성을 가지는, 셀룰라제 효소 암호화 핵산 예를 들어, 엔도글루카나제 효소 암호화 핵산, 셀로바이오하이드롤라제 효소-암호화 핵산 및/또는 베타-글루코시다제 효소 암호화 핵산, 예를 들어 본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열[이하의 표 1a∼1c, 2 및 3과, 실시예 1 및 4, 그리고 서열 목록 참조], 본 발명의 효소를 비롯한 이 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 예를 들어 본 발명의 대표적인 폴리펩티드, 예를 들어 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164 또는 서열 번호 166을 제공한다[이하의 표 1a∼1c 및 서열 목록 참조]. 하나의 측면에서, 본 발명은 또한 환경적 공급원, 예를 들어 혼합 환경적 공급원으로부터 유래한다는 점에서 공통된 신규성을 가지는, 셀룰라제 효소 암호화 핵산, 예를 들어, 엔도글루카나제 효소 암호화 핵산, 셀로바이오하이드롤라제 효소 암호화 핵산 및/또는 베타-글루코시다제 효소 암호화 핵산을 제공한다.
하나의 측면에서, 서열 비교 알고리즘은 BLAST 버젼 2.2.2 알고리즘으로서, 필터링 셋팅(filtering setting)이 blastall -p blastp -d"nr pataa" -F F로 설정되고, 다른 모든 선택 사양은 디폴트값으로 설정된 알고리즘이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 핵산 서열 중 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450 또는 2500개 이상의 연속된 염기를 포함하는 분리된 또는 재조합 핵산, 이와 실질적으로 동일한 서열 및 이에 상보성인 서열에 관한 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명의 분리된 또는 재조합 핵산은 열 안정성인 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 본 발명의 폴리펩티드는 온도 약 37∼약 95℃, 약 55∼약 85℃, 약 70∼약 95℃, 또는 약 90∼약 95℃를 포함하는 조건 하에서 셀룰라제 활성을 보유할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 온도 약 1∼약 5℃, 약 5∼약 15℃, 약 15∼약 25℃, 약 25∼약 37℃, 약 37∼약 95℃, 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃, 약 55∼약 85℃, 약 70∼약 75℃, 또는 약 90∼약 99℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃ 이상에서 셀룰라제 활성을 보유할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 분리된 또는 재조합 핵산은 열 내성이며, 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 본 발명의 폴리펩티드는 37∼약 95℃의 온도 또는 55∼약 85℃의 온도 중 임의의 온도에 노출된 후에도 셀룰라제 활성을 유지할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 1∼약 5℃, 약 5∼약 15℃, 약 15∼약 25℃, 약 25∼약 37℃, 약 37∼약 95℃, 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃, 약 55∼약 85℃, 약 70∼약 75℃, 또는 약 90∼약 95℃의 온도에 노출된 후에도 셀룰라제 활성을 유지할 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 90∼약 99℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃ 또는 99℃의 온도 및 pH 약 4.5 이상에 노출된 후에도 셀룰라제 활성을 유지할 수 있다.
본 발명은 엄중한 조건 하에서 본 발명의 핵산에 혼성화되는 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 핵산을 제공하는데, 여기서, 상기 본 발명의 대표적 핵산의 예로서는 예를 들어, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 85, 서열 번호 87, 서열 번호 89, 서열 번호 91, 서열 번호 93, 서열 번호 95, 서열 번호 97, 서열 번호 99, 서열 번호 101, 서열 번호 103, 서열 번호 105, 서열 번호 107, 서열 번호 109, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 115, 서열 번호 117, 서열 번호 119, 서열 번호 121, 서열 번호 123, 서열 번호 125, 서열 번호 127, 서열 번호 129, 서열 번호 131, 서열 번호 133, 서열 번호 135, 서열 번호 137, 서열 번호 139, 서열 번호 141, 서열 번호 143, 서열 번호 145, 서열 번호 147, 서열 번호 149, 서열 번호 151, 서열 번호 153, 서열 번호 155, 서열 번호 157, 서열 번호 159, 서열 번호 161, 서열 번호 163 또는 서열 번호 165에 제시된 서열(이하, 표 1a∼1c, 2 및 3과, 실시예 1 및 4 참조), 또는 이의 단편이나 부분 서열을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 핵산은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다. 본 발명의 핵산은 길이 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200 개 이상인 잔기이거나 또는 전체 길이인 유전자 또는 전사체일 수 있다. 하나의 측면에서, 엄중 조건은 약 65℃의 온도에서 약 15분 동안 0.2×SSC 중에 세척하는 것을 포함하는 세척 단계를 포함한다.
본 발명은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정 또는 분리하기 위한 핵산 프로브를 제공하는데, 여기서, 상기 프로브는 본 발명의 서열을 포함하는, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 개 이상의 연속적인 염기 서열들, 또는 이의 단편이나 부분 서열을 포함하며, 상기 프로브는 결합 또는 혼성화에 의해 핵산을 동정한다. 상기 프로브는 본 발명의 서열을 포함하는, 약 10∼50개, 약 20∼60개, 약 30∼70개, 약 40∼80개, 또는 약 60∼100개 이상의 연속적인 염기 서열들을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 단편이나 부분 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 동정 또는 분리하기 위한 핵산 프로브를 제공하는데, 여기서, 상기 프로브는 본 발명의 핵산 잔기를 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개 이상 포함하는 서열을 포함하는 핵산 예를 들어, 본 발명의 대표적인 핵산과의 동일성이 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이거나 완벽한(100%) 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석법 또는 시각적 조사에 의해 측정된다. 대안적인 측면에서, 프로브는 본 발명의 핵산 서열 중 약 10∼50개, 약 20∼60개, 약 30∼70개, 약 40∼80개 또는 약 60∼100개의 연속된 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 부분 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭(예를 들어, PCR에 의함)시키기 위한 증폭용 프라이머 쌍을 제공하는데, 상기 프라이머 쌍은 본 발명의 서열을 포함하는 핵산, 또는 이의 단편이나 부분 서열을 증폭시킬 수 있다. 증폭용 프라이머 서열 쌍의 하나 또는 각각의 일원은 약 10∼50개 이상의 연속적인 염기 서열, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 이상의 연속적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명은 증폭용 프라이머 쌍을 제공하는데, 이 프라이머 쌍은 본 발명의 핵산 잔기를, 앞(5' 말단)에서부터 시작하여 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 이상 포함하는 서열을 가지는 제1 일원, 그리고 상기 제1 일원의 상보성 가닥 잔기를, 앞(5' 말단)에서부터 시작하여 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 이상 포함하는 서열을 가지는 제2 일원을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 증폭용 프라이머 쌍을 이용하는 증폭 반응 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산되는, 셀룰라제 암호화 핵산 예를 들어, 엔도글루카나제-암호화 핵산, 셀로바이오하이드롤라제-암호화 핵산 및/또는 베타-글루코시다제-암호화 핵산을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 증폭용 프라이머 쌍을 이용하는 증폭 반응 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산되는, 셀룰라제 암호화 핵산 예를 들어, 엔도글루카나제-암호화 핵산, 셀로바이오하이드롤라제-암호화 핵산 및/또는 베타-글루코시다제-암호화 핵산을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 증폭용 프라이머 쌍을 이용하는 증폭 반응 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 증폭용 프라이머 쌍은 라이브러리 예를 들어, 유전자 라이브러리 예를 들어, 환경 라이브러리(environmental library)로부터 핵산을 증폭시킨다.
본 발명은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 핵산 서열, 또는 이의 단편이나 부분 서열을 증폭시킬 수 있는 증폭용 프라이머 서열 쌍을 이용하여 주형 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 핵산이나 이의 부분 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 포유동물 프로모터 또는 식물 프로모터일 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 식물 프로모터는 감자, 쌀, 옥수수, 밀, 담배 또는 보리의 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 상기 구성적 프로모터는 CaMV35S를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 프로모터는 조직-특이적 프로모터이거나 또는 환경에 의해 조절되거나 성장함에 따라서 조절되는 프로모터일 수 있다. 그러므로, 상기 프로모터는 예를 들어, 종자-특이적, 잎-특이적, 뿌리-특이적, 줄기-특이적 또는 이탈-유도성 프로모터일 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 발현 카세트는 또한 식물 또는 식물 바이러스 발현 벡터를 포함할 수도 있다.
본 발명은 본 발명의 발현 카세트(예를 들어, 벡터) 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 클로닝 비이클을 제공한다. 상기 클로닝 비이클은 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지 또는 인공 염색체일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 상기 클로닝 비이클은 박테리아의 인공 염색체(BAC), 플라스미드, 박테리오파지 P1-유래 벡터(PAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 포유동물 인공 염색체(MAC)를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 카세트(예를 들어, 벡터), 또는 본 발명의 클로닝 비이클을 포함하는 형질전환 세포를 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 형질전환 세포는 박테리아 세포, 포유 동물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 하나의 측면에서, 식물 세포는 대두, 유채씨, 유지 종자, 토마토, 사탕수수, 곡류, 감자, 밀, 쌀, 옥수수, 담배 또는 보리의 세포일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 카세트(예를 들어, 벡터)를 포함하는 트랜스제닉 비인간 동물을 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 동물은 마우스, 래트, 돼지, 염소 또는 양이다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 카세트(예를 들어, 벡터)를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제공한다. 상기 트랜스제닉 식물은 곡류, 옥수수, 감자, 토마토, 밀, 유지 종자, 유채씨, 대두, 쌀, 보리 또는 담배 식물일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 카세트(예를 들어, 벡터)를 포함하는 트랜스제닉 종자를 제공한다. 상기 트랜스제닉 종자는 곡류, 옥수수, 밀알, 유지 종자, 유채씨, 대두씨, 야자씨, 해바라기씨, 참깨씨, 땅콩 또는 담배 식물의 종자일 수 있다.
본 발명은 엄중한 조건 하에서 본 발명의 핵산에 혼성화할 수 있거나 또는 이에 상보성인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 메세지가 세포 내에서 번역되는 것을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 엄중한 조건 하에서 본 발명의 핵산에 혼성화할 수 있거나 또는 이에 상보성인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입하거나 또는 이를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 10∼50개, 약 20∼60개, 약 30∼70개, 약 40∼80개, 또는 약 60∼100개의 염기 예를 들어, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 개 이상의 염기이다. 본 발명은 셀룰라제 효소 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 메세지가 세포 내에서 번역되는 것을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 엄중한 조건 하에서 본 발명의 핵산에 혼성화할 수 있거나 또는 이에 상보성인 핵산 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 투여하거나 또는 이를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 서열의 부분 서열을 포함하는, 이중 가닥 억제성 RNA(RNAi 또는 RNA 간섭) 분자(예를 들어, 전사를 억제하는 소 간섭 RNA 또는 siRNA와, 번역을 억제하는 마이크로 RNA 또는 miRNA)를 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 siRNA는 길이가 약 21∼24개인 잔기이거나 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 이상인 이중체 뉴클레오티드이다. 본 발명은 셀룰라제 효소 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소가 세포 내에서 발현되는 것을 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 이중 가닥 억제성 RNA(siRNA 또는 miRNA)를 세포에 도입하거나 또는 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하고, 상기 RNA는 본 발명의 서열의 부분 서열을 포함한다.
본 발명은 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 또는 350개 이상의 잔기로 이루어진 부위, 또는 폴리펩티드 전체 길이에 걸쳐서, 본 발명의 대표적인 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 서열 동일성이 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이거나 완벽한(100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘을 사용하는 분석법 또는 시각적 조사에 의해 측정된다. 본 발명의 대표적인 폴리펩티드 또는 펩티드 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164 및 서열 번호 166의 서열[이하의 표 1a∼1c, 2 및 3, 실시예 1 및 4, 그리고 서열 목록 참조]과, 이의 부분 서열 및 변이체를 포함한다. 대표적인 폴리펩티드는 또한 길이 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600개 이상의 잔기로 이루어진 단편, 또는 전체 길이 효소를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드 서열은 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합되는 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 에피토프), 또는 본 발명의 항체를 생산할 수 있는 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 면역원)를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 셀룰라제 효소 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 갖는다. 대안적인 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀룰라제 효소 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
하나의 측면에서, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 열 안정성이다. 본 발명의 폴리펩티드는 온도 약 1∼약 5℃, 약 5∼약 15℃, 약 15∼약 25℃, 약 25∼약 37℃, 약 37∼약 95℃, 약 55∼약 85℃, 약 7O∼약 75℃, 또는 약 9O∼95℃ 이상인 조건 하에서 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유할 수 있다. 다른 측면에서, 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 열 내성일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 온도 37∼약 95℃ 또는 55∼약 85℃에 노출된 후에 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 유지할 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 90∼약 95℃의 온도에서 pH4.5에 노출된 후에도 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 유지할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드 서열 중 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125 또는 150개 이상의 연속된 염기를 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드 또는 펩티드, 이와 실질적으로 상동성인 서열, 그리고 이와 상보성인 서열을 제공한다. 이 펩티드는 예를 들어, 면역원성 단편, 모티프(예를 들어, 결합 위치), 신호 서열, 프리프로 서열(prepro sequence) 또는 활성 위치일 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및 신호 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 핵산을 제공하는데, 여기서, 상기 핵산은 본 발명의 서열을 포함한다. 신호 서열은 다른 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 또는 비-셀룰라제 예를 들어, 비-엔도글루카나제, 비-셀로바이오하이드롤라제 및/또는 비-베타-글루코시다제 효소(이종성 효소)로부터 유래될 수 있다. 본 발명은 셀룰라제 활성 예를 들어, 엔도글루카나제 활성, 셀로바이오하이드롤라제 활성, 만난아제 활성 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 또는 재조합 핵산을 제공하며, 여기서, 상기 서열은 신호 서열을 함유하지 않고, 상기 핵산은 본 발명의 서열을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 신호 서열의 전부 또는 일부가 결여된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 측면에서, 분리된 또는 재조합 폴리펩티드는 이종 신호 서열 예를 들어, 이종 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 신호 서열 또는 비-셀룰라제 예를 들어, 비-엔도글루카나제, 비-셀로바이오하이드롤라제 및/또는 비-베타-글루코시다제 효소 신호 서열을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 신호 서열을 포함하는 제1 도메인과 적어도 제2 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 제2 도메인은 효소를 포함할 수 있다. 상기 효소는 비-효소(non-enzyme)일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매 도메인(CD)을 포함하는 적어도 제1 도메인과, 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 적어도 제2 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 자연적으로는 신호 서열(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매 도메인(CD)과 결합되어 있지 않다. 하나의 측면에서, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소가 아니다. 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 신호 펩티드(SP), 프리프로 서열 및/또는 촉매 도메인(CD)의 아미노 말단, 카복시 말단 또는 이들 양 말단부일 수 있다.
본 발명은 키메라 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산을 제공하는데, 여기서, 상기 키메라 폴리펩티드는 본 발명의 신호 펩티드(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)을 포함하는 적어도 제1 도메인과, 이종 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 적어도 제2 도메인을 포함하며, 상기 이종 폴리펩티드 또는 펩티드는 자연적으로는 신호 펩티드(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)과 결합되어 있지 않다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 86, 서열 번호 88, 서열 번호 90, 서열 번호 92, 서열 번호 94, 서열 번호 96, 서열 번호 98, 서열 번호 100, 서열 번호 102, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 108, 서열 번호 110, 서열 번호 112, 서열 번호 114, 서열 번호 116, 서열 번호 118, 서열 번호 120, 서열 번호 122, 서열 번호 124, 서열 번호 126, 서열 번호 128, 서열 번호 130, 서열 번호 132, 서열 번호 134, 서열 번호 136, 서열 번호 138, 서열 번호 140, 서열 번호 142, 서열 번호 144, 서열 번호 146, 서열 번호 148, 서열 번호 150, 서열 번호 152, 서열 번호 154, 서열 번호 156, 서열 번호 158, 서열 번호 160, 서열 번호 162, 서열 번호 164 또는 서열 번호 166의 1∼14, 1∼15, 1∼16, 1∼17, 1∼18, 1∼19, 1∼20, 1∼21, 1∼22, 1∼23, 1∼24, 1∼25, 1∼26, 1∼27, 1∼28, 1∼29, 1∼30, 1∼31, 1∼32, 1∼33, 1∼34, 1∼35, 1∼36, 1∼37, 1∼38, 1∼40, 1∼41, 1∼42, 1∼43, 1∼44, 1∼45, 1∼46 또는 1∼47번 잔기에 제시된 바와 같은 서열로 이루어져 있거나 또는 이를 포함하는 분리된 또는 재조합 신호 서열(예를 들어, 신호 펩티드)를 제공한다[이하의 표 1a∼1c, 2 및 3과, 실시예 1 및 4, 그리고 서열 목록 참조]. 하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 처음 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70개 또는 그 이상의 아미노 말단 잔기를 포함하는 신호 서열을 제공한다.
하나의 측면에서, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 약 37℃에서 단백질 1 ㎎ 당 약 1∼약 1200 유닛, 또는 단백질 1 ㎎ 당 약 100∼약 1000 유닛의 비활성(specific activity)을 포함한다. 다른 측면에서, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 단백질 1 ㎎ 당 약 100∼약 1000 유닛, 또는 단백질 1 ㎎ 당 약 500∼약 750 유닛의 비활성을 포함한다. 대안적으로, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 37℃에서 단백질 1 ㎎ 당 약 1∼약 750 유닛, 또는 단백질 1 ㎎ 당 약 500∼약 1200 유닛의 비활성을 포함한다. 하나의 측면에서, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 37℃에서 단백질 1 ㎎ 당 약 1∼약 500 유닛, 또는 단백질 1 ㎎ 당 약 750∼약 1000 유닛의 비활성을 포함한다. 다른 측면에서, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 37℃에서 단백질 1 ㎎ 당 약 1∼약 250 유닛의 비활성을 포함한다. 대안적으로, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 37℃에서 단백질 1 ㎎ 당 약 1∼약 100 유닛의 비활성을 포함한다.
다른 측면에서, 열 내성은 고온으로 가열한 후에도 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 37℃에서의 비활성의 절반 이상을 유지하는 경우를 포함한다. 대안적으로, 열 내성은 고온으로 가열한 후에도 37℃에서의 비활성이 단백질 1 ㎎ 당 약 1∼약 1200 유닛이거나 단백질 1 ㎎ 당 약 500∼약 1000 유닛인 경우를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 열 내성은 고온으로 가열한 후에도 37℃에서의 비활성이 단백질 1 ㎎당 약 1∼약 500 유닛인 경우를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 분리된 또는 재조합 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 하나의 측면에서, 글리코실화는 N-결합 글리코실화일 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 폴리펩티드는 피. 파스토리스(P. pastoris) 또는 에스. 폼베(S. pombe)에서 발현된 이후에도 글리코실화될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 대략 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4 또는 그 이상의 산성도를 포함하는 조건 하에서 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 유지할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 대략 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5 또는 pH 11 또는 그 이상의 염기성 pH를 포함하는 조건 하에서 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 유지할 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 폴리펩티드는 대략 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 또는 pH 4 또는 그 이상의 산성도를 포함하는 조건에 노출된 후에도 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 유지할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 대략 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5 또는 pH 11 또는 그 이상의 염기성 pH를 포함하는 조건에 노출된 후에도 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 유지할 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명의 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소는 알칼리성 조건 예를 들어, 장 예를 들어, 소장의 알칼리성 조건 하에서 활성을 가진다. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 위와 같은 산성 pH에 노출된 후에도 활성을 유지할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 포함)를 포함하는 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, 상기 단백질 제제는 액체, 고체 또는 겔을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 제2 단백질 또는 도메인을 포함하는 이종이량체를 제공한다. 상기 이종이량체의 제2 일원은 상이한 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소, 상이한 효소 또는 기타 단백질일 수 있다. 하나의 측면에서, 제2 도메인은 폴리펩티드일 수 있고, 이종이량체는 융합 단백질일 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 제2 도메인은 에피토프 또는 태그일 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체를 제공한다.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 고정화된(immobilized) 폴리펩티드(펩티드 포함)를 제공하는데, 여기서, 상기 고정화된 폴리펩티드는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드와 제2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 세포, 금속, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 미세 전극, 흑연 입자, 비드, 겔, 평판, 어레이 또는 모세관 상에 고정화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 고정화된 핵산 예를 들어, 본 발명의 프로브를 포함하는 어레이를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는 어레이를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하거나, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 또는 재조합 항체를 제공한다. 이와 같이 본 발명의 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 하이브리도마를 제공한다. 본 발명은 이러한 항체를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 분리 또는 동정하는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 방법은 (a) 본 발명의 항체를 제공하는 단계; (b) 폴리펩티드를 포함하는 시료를 제공하는 단계; 및 (c) 항체가 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 조건 하에서 상기 단계 (b)의 시료와 상기 단계 (a)의 항체를 접촉시켜, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 분리 또는 동정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 항-셀룰라제 효소 항체 예를 들어, 항-엔도글루카나제 효소 항체, 항-셀로바이오하이드롤라제 효소 항체 및/또는 항-베타-글루코시다제 효소 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 여기서, 이 방법은 비인간 동물에 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 부분 서열을 체액 면역 반응을 일으키기에 충분한 양만큼 투여하여, 항-셀룰라제 효소 항체 예를 들어, 항-엔도글루카나제 효소 항체, 항-셀로바이오하이드롤라제 효소 항체 및/또는 항-베타-글루코시다제 효소 항체를 생산하는 단계를 포함한다. 본 발명은 항-셀룰라제 면역 반응 예를 들어, 항-엔도글루카나제 면역 반응, 항-셀로바이오하이드롤라제 면역 반응 및/또는 항-베타-글루코시다제 면역 반응(세포성 또는 체액 면역 반응)을 일으키는 방법을 제공하는데, 여기서, 이 방법은 비인간 동물에 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 부분 서열을 면역 반응(세포성 또는 체액 면역 반응)을 일으키는데에 충분한 양만큼 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 다음과 같은 단계들을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다: (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 조건 하에서 상기 단계 (a)의 핵산을 발현시켜, 재조합 폴리펩티드를 생산하는 단계. 하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 단계 (a)의 핵산으로 숙주 세포를 형질전환한 후, 상기 단계 (a)의 핵산을 발현시켜, 형질전환된 세포 내에서 재조합 폴리펩티드를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 단계들을 포함하는, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 동정하는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 기질을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드 또는 이의 단편이나 변이체와 상기 단계 (b)의 기질을 접촉시켜, 기질 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 검출하는 단계[여기서, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 통하여, 상기 폴리펩티드가 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는지 여부를 확인할 수 있음]. 하나의 측면에서, 상기 기질은 셀룰로스-포함 화합물이다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 기질의 동정 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 시험 기질을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드와 상기 단계 (b)의 시험 기질을 접촉시켜, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 검출하는 단계[여기서, 기질의 양의 감소 또는 반응 생성물의 양의 증가를 통하여, 상기 시험 기질이 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 기질과 같은 시험 기질임을 확인할 수 있음].
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 시험 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다: (a) 핵산을 폴리펩티드로 번역시킬 수 있는 조건 하에서 핵산을 포함하는 벡터 또는 핵산을 발현시키거나[여기서, 상기 핵산은 본 발명의 핵산을 포함함], 또는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 시험 화합물을 제공하는 단계; (c) 이 시험 화합물과 폴리펩티드를 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 단계 (b)의 시험 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성의 조절제를 동정하는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 시험 화합물을 제공하는 단계; (c) 상기 단계 (a)의 폴리펩티드와 상기 단계 (b)의 시험 화합물을 접촉시켜, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 측정하는 단계로서, 여기서 시험 화합물의 부재 하에서 측정된 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성에 비교한, 시험 화합물의 존재 하에서 측정된 상기 효소들의 활성에 있어서의 변화는 상기 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 조정하는 시험 화합물이 존재하는 증거가 되는 것인 단계. 하나의 측면에서, 상기 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성은, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 기질을 제공하여, 이 기질의 양이 감소하는지 아니면 반응 생성물의 양이 증가하는지, 또는 시질의 양이 증가하는지 아니면 반응 생성물의 양이 감소하는지를 확인함으로써 측정될 수 있다. 시험 화합물이 존재하지 않을 경우의 기질 또는 반응 생성물의 양에 비교한, 시험 화합물이 존재할 경우의 기질 양의 감소 또는 반응 생성물 양의 증가 여부는, 이 시험 화합물이 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성에 대한 활성화 인자인지 여부를 확인해준다. 시험 화합물이 존재하지 않을 경우의 기질 또는 반응 생성물의 양에 비교한, 시험 화합물이 존재할 경우의 기질 양의 감소 또는 반응 생성물 양의 증가 여부는, 이 시험 화합물이 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성의 억제제인지 여부를 확인해준다.
본 발명은 프로세서 및 데이터 저장 장치를 포함하는 컴퓨터 시스템을 제공하는데, 여기서, 상기 데이터 저장 장치는 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열(예를 들어, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 펩티드)을 저장하고 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 컴퓨터 시스템은 또한 하나 이상의 참조 서열이 저장되어 있는 데이터 저장 장치와 서열 비교 알고리즘을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 서열 비교 알고리즘은 다형성을 나타내는 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 컴퓨터 시스템은 또한 상기 서열에 존재하는 하나 이상의 특징들을 동정하는 식별자(identifier)를 포함할 수도 있다. 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열이 저장되어 있는 컴퓨터 판독 가능 매체를 제공한다. 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 서열의 특징을 동정하는 방법을 제공한다: (a) 서열 내 하나 이상의 특징들을 동정하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열을 판독하는 단계[여기서, 상기 서열은 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 포함함]; 및 (b) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 내의 하나 이상의 특징들을 동정하는 단계. 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 제2 서열과 제1 서열의 비교 방법을 제공한다: (a) 서열을 비교하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열과 제2 서열을 판독하는 단계[여기서, 상기 제1 서열은 본 발명의 폴리펩티드 서열 또는 핵산 서열을 포함함]; 및 (b) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 제1 서열과 제2 서열 간의 차이점을 측정하는 단계. 상기 제1 서열과 제2 서열 간의 차이점을 측정하는 단계는 또한 다형성을 동정하는 단계를 포함할 수도 있다. 하나의 측면에서, 이 방법은 또한 서열 내의 하나 이상의 특징들을 동정하는 식별자를 포함할 수도 있다. 다른 측면에서, 이 방법은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 제1 서열을 판독하는 단계 및 이 서열 내의 하나 이상의 특징들을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 환경 시료로부터 분리 또는 회수하는 방법을 제공하는데, 여기서, 이 방법은 (a) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 증폭시키기 위한 증폭용 프라이머 서열 쌍을 제공하는 단계[여기서, 상기 프라이머 쌍은 본 발명의 핵산을 증폭시킬 수 있음]; (b) 환경 시료로부터 핵산을 분리하거나, 또는 이 환경 시료 내에 존재하는 핵산이 증폭용 프라이머 쌍에 혼성화할 수 있도록 이 시료를 처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 핵산과 상기 단계 (a)의 증폭용 프라이머 쌍을 결합시키고, 이 환경 시료로부터 핵산을 증폭시켜, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 환경 시료로부터 분리 또는 회수하는 단계를 포함한다. 증폭용 프라이머 서열 쌍의 하나 또는 각각의 일원은 본 발명의 증폭용 프라이머 서열 쌍을 포함하는 올리고뉴클레오티드 예를 들어, 본 발명의 연속된 염기 서열을 약 10∼50개 이상 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 환경 시료로부터 분리 또는 회수하는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 핵산 또는 이의 부분 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공하는 단계; (b) 환경 시료로부터 핵산을 분리하거나, 또는 이 환경 시료 내에 존재하는 핵산이 상기 단계 (a)의 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화될 수 있도록 이 환경 시료를 처리하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 분리된 핵산 또는 처리된 환경 시료를 상기 단계 (a)의 폴리뉴클레오티드 프로브와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a)의 폴리뉴클레오티드 프로브와 특이적으로 혼성화하는 핵산을 분리하여, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 환경 시료로부터 분리 또는 회수하는 단계. 상기 환경 시료는 물 시료, 액체 시료, 흙 시료, 공기 시료 또는 생물학적 시료를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 생물학적 시료는 박테리아 세포, 원생 동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포로부터 유래할 수 있다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 변이체를 제조하는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 핵산을 포함하는 주형 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 주형 서열에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 변형, 결실 또는 추가하거나, 또는 이러한 작업들을 조합하여 수행함으로써, 주형 핵산의 변이체를 생산하는 단계. 하나의 측면에서, 이 방법은 또한 변이체 핵산을 발현시켜 변이체 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 폴리펩티드를 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 변형, 부가 또는 결실은 오류 빈발 PCR, 셔플링(shuffling), 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법, 어셈블리 PCR, 유성(sexual) PCR 돌연변이 유발법, 생체내 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 반복적 앙상블 돌연변이 유발법(recursive ensemble mutagenesis), 지수적 앙상블 돌연변이 유발법(exponential ensemble mutagenesis), 위치 특이적 돌연변이 유발법, 유전자 재조립법, 유전자 위치 포화 돌연변이 유발법(Gene Site Saturation Mutagenesis; GSSM), 합성 결찰 재조립법(SLR), 염색체 포화 돌연변이 유발법(CSM) 또는 이 방법들의 조합법을 포함하는 방법에 의해서 도입될 수 있다. 다른 측면에서, 상기 변형, 부가 또는 결실은 재조합법, 반복적 서열 재조합법, 포스포티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발법, 우라실 함유 주형 돌연변이 유발법, 갭 형성 이중체 돌연변이 유발법, 포인트 미스매치 수복 돌연변이 유발법, 수복 결함 숙주 균주 돌연변이 유발법, 화학적 돌연변이 유발법, 방사능에 의한 돌연변이 유발법, 결실 돌연변이 유발법, 제한 선별 돌연변이 유발법, 제한 정제 돌연변이 유발법, 인공 유전자 합성법, 앙상블 돌연변이 유발법, 키메라 핵산 다량체 생성법 및 이들 방법의 조합법을 포함하는 방법에 의해 도입된다.
하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소가 변형되었거나 또는 상이한 활성을 가지게 될 때까지, 또는 주형인 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 안정성과 상이한 안정성을 가지거나 또는 변질된 안정성을 가지게 될 때까지 반복 수행할 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 변이체 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 폴리펩티드는 열 내성으로서, 고온에 노출된 후에도 다소의 활성을 유지한다. 다른 측면에서, 본 발명의 변이체 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 폴리펩티드는, 주형 핵산에 의해 암호화되는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소에 비해, 글리코실화 효율이 증가한다. 대안적으로, 본 발명의 변이체 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 폴리펩티드는 고온에서도 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 활성을 보유하는데, 여기서, 주형 핵산에 의해 암호화되는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소는 고온에서는 활성을 가지지 않는다. 하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 암호화하는 서열의 코돈 사용 패턴이 주형 핵산의 경우와 상이하게 변할 때까지 반복적으로 수행될 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 유전자의 메세지 발현 수준 또는 안정성이 주형 핵산에 의한 경우보다 높거나 또는 낮게 될 때까지 반복적으로 수행될 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내에 존재하는 코돈을 변형시켜 이것의 숙주 세포에서의 발현량을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는, 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산 내에 존재하는 비선호 코돈 또는 저선호 코돈을 확인하고, 이를 치환된 코돈이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는, 중립 사용 코돈 또는 선호 코돈과 치환시킴으로써, 이 핵산을 변형시켜 숙주 세포에서의 발현량을 증가시키는 단계[여기서, 상기 선호 코돈은 숙주 세포 내에 존재하는 유전자 내의 암호화 서열에서 과다 출현하는(over-represented) 코돈이고, 상기 비선호 코돈 또는 저선호 코돈은 숙주 세포 내에 존재하는 유전자 내의 암호화 서열에서 적게 출현하는(under-represented) 코돈임].
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내에 존재하는 코돈을 변형시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산 내에 존재하는 코돈을 확인하여, 이를 치환된 코돈이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈으로 치환함으로써, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 암호화하는 핵산 내에 존재하는 코돈을 변형시키는 단계.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내에 존재하는 코돈을 변형시켜, 숙주 세포 내에서 이 변형된 코돈의 발현량을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산 내에 존재하는 비선호 코돈 또는 저선호 코돈을 확인하여, 이를 치환된 코돈이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 중립 사용 코돈 또는 선호 코돈과 치환함으로써, 이 핵산을 변형시켜 숙주 세포에서의 발현량을 증가시키는 단계[여기서, 상기 선호 코돈은 숙주 세포 내에 존재하는 유전자 내의 암호화 서열에서 과다 출현하는 코돈이고, 상기 비선호 코돈 또는 저선호 코돈은 숙주 세포 내에 존재하는 유전자 내의 암호화 서열에서 적게 출현하는 코돈임].
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 내에 존재하는 코돈을 변형시켜, 숙주 세포 내에서 이 코돈의 발현량을 감소시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 본 발명의 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 핵산 내에 존재하는 하나 이상의 선호 코돈을 확인하여, 이를 치환된 코돈이 암호화하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화하는 저선호 코돈 또는 비선호 코돈과 치환함으로써, 이 핵산을 변형시켜, 숙주 세포에서의 발현량을 감소시키는 단계[여기서, 상기 선호 코돈은 숙주 세포 내에 존재하는 유전자 내의 암호화 서열에서 과다 출현하는 코돈이고, 비선호 코돈 또는 저선호 코돈은 숙주 세포 내에 존재하는 유전자 내의 암호화 서열에서 적게 출현하는 코돈임]. 하나의 측면에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명은 다수의 변형된 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성 부위 또는 기질 결합 부위를 암호화하는 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서, 이 변형된 활성 부위 또는 기질 결합 부위는 제1 활성 부위 또는 제1 기질 결합 부위를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산으로부터 유래하고, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 제1 활성 부위 또는 제1 기질 결합 부위를 암호화하는 제1 핵산을 제공하는 단계[여기서, 상기 제1 핵산 서열은 엄중한 조건 하에서 본 발명의 핵산에 혼성화되는 서열을 포함하고, 상기 핵산은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성 부위, 또는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 기질 결합 부위를 암호화함]; (b) 자연 발생 아미노산 변이체를 암호화하는 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 세트를, 제1 핵산 내 다수의 표적 코돈에 제공하는 단계; 및 (c) 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여, 돌연변이가 유발된 각각의 아미노산 코돈에 일정 범위의 아미노산 변이체를 암호화하는, 기질 결합 부위 암호화 변이체 핵산 또는 활성 부위 암호화 변이체 핵산 세트를 생성시킴으로써, 다수의 변형된 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성 부위 또는 기질 결합 부위를 암호화하는 핵산의 라이브러리를 제조하는 단계. 하나의 측면에서, 상기 방법은 상기 단계 (a)의 제1 핵산을, 최적화 유도 진화 시스템, 유전자 위치 포화 돌연변이 유발법(GSSM), 합성 결찰 재조립법(SLR), 오류 빈발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법, 어셈블리 PCR, 유성 PCR 돌연변이 유발법, 생체내 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 반복적 앙상블 돌연변이 유발법, 지수적 앙상블 돌연변이 유발법, 위치 특이적 돌연변이 유발법, 유전자 재조립법 및 상기 방법들의 조합법을 포함하는 방법에 의해 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 상기 단계 (a)의 제1 핵산 또는 변이체를, 재조합법, 반복적 서열 재조합법, 포스포티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발법, 우라실 함유 주형 돌연변이 유발법, 갭 형성 이중체 돌연변이 유발법, 포인트 미스매치 수복 돌연변이 유발법, 수복 결함 숙주 균주 돌연변이 유발법, 화학적 돌연변이 유발법, 방사능에 의한 돌연변이 유발법, 결실 돌연변이 유발법, 제한 선별 돌연변이 유발법, 제한 정제 돌연변이 유발법, 인공 유전자 합성법, 앙상블 돌연변이 유발법, 키메라 핵산 다량체 생성법 및 이들 방법의 조합법을 포함하는 방법에 의해 돌연변이 유발시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 소형 분자 제조 방법을 제공한다: (a) 소형 분자를 합성 또는 변형시킬 수 있는 다수의 생합성 효소를 제공하는 단계[여기서, 상기 효소 중 하나는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 포함함]; (b) 상기 단계 (a)의 효소 중 하나 이상에 대한 기질을 제공하는 단계; 및 (c) 다수의 생체 촉매 반응을 촉진하는 조건 하에서 상기 단계 (b)의 기질과 효소를 반응시켜, 일련의 생체 촉매 반응에 의해 소형 분자를 생성하는 단계. 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 소형 분자의 변형 방법을 제공한다: (a) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 제공하는 단계[여기서, 상기 효소는 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 이의 부분 서열을 포함함]; (b) 소형 분자를 제공하는 단계; 및 (c) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소에 의해 촉재화되는 효소 반응을 촉진하는 조건 하에서 상기 단계 (a)의 효소를 상기 단계 (b)의 소형 분자와 반응시켜, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 반응에 의해 소형 분자를 변형시키는 단계. 하나의 측면에서, 이 방법은 상기 단계 (a)의 효소에 대한 소형 분자 기질을 다수 포함하므로, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소에 의해 촉진되는 하나 이상의 효소 반응에 의해 생산되는 변형된 소형 분자 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 이 방법은 다수의 생체 촉매 반응이 효소에 의해 촉진되는 조건 하에서, 다수의 부가 효소들을 사용하여 다수의 효소 반응에 의해 생산되는 변형된 소형 분자 라이브러리를 제조하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 이 방법은 바람직한 활성을 나타내는 특정의 변형된 소형 분자가 라이브러리 내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 라이브러리를 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 라이브러리를 시험하는 단계는, 원하는 활성을 보유하는 변형된 특정 소형 분자의 존부에 대해 변형된 소형 분자의 일부를 시험함으로써 라이브러리 내에 존재하는 다수의 변형된 소형 분자 중 일부를 생산하는데에 사용된 생체 촉매 반응 중 하나를 제외하고는 모두 체계적으로 제외시키고고, 원하는 활성을 보유하는 변형된 특정 소형 분자를 생성하는 하나 이상의 특정 생체 촉매 반응을 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 기능성 단편을 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 제공하는 단계[여기서, 상기 효소는 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 이의 부분 서열을 포함함]; 및 (b) 상기 단계 (a)의 서열로부터 다수의 아미노산 잔기를 결실시키고, 나머지 부분 서열이 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는지 여부에 대해 시험함으로써, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소의 기능성 단편을 결정하는 단계. 하나의 측면에서, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은, 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 기질을 제공하고, 기질 양의 감소 또는 반응 생성물 양의 증가를 확인함으로써 측정된다.
본 발명은 실시간 대사 흐름 분석(real-time metabolic flux analysis)을 사용하여, 신규 또는 변형 표현형을 가지는 전 세포를 조작하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 세포의 유전자 조성을 변형시켜 변형된 세포를 제조하는 단계[여기서, 상기 유전자 조성은 본 발명의 핵산을 세포에 첨가함으로써 변형됨]; (b) 변형된 세포를 배양하여 다수의 변형된 세포를 생산하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 세포 배양액을 실시간으로 모니터하여 세포에 관한 하나 이상의 대사 매개 변수를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 데이터를 분석하여, 측정된 매개 변수가, 유사한 조건 하에서 측정된 비변형 세포에서의 유사한 측정치와 상이한지 여부를 결정함으로써, 실시간 대사 흐름 분석법을 이용하여 세포 내에서 조작된 표현형이 나타나는지 확인하는 단계. 하나의 측면에서, 상기 세포의 유전자 조성은, 세포 내에서 서열을 결실시키거나 또는 서열을 변형시키거나, 또는 유전자의 발현을 억제(knock-out)하는 단계를 포함하는 방법에 의해 변형될 수 있다. 하나의 측면에서, 이 방법은 새로이 조작된 표현형을 포함하는 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 이 방법은 선별된 세포를 배양하여, 새로이 조작된 표현형을 나타내는 신규의 세포 균주를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 폴리펩티드의 열 내성 또는 열 안정성을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 폴리펩티드를 글리코실화시키고[여기서, 상기 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드 중 30개 이상의 연속 아미노산을 포함함], 이로써 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 폴리펩티드의 열 내성 또는 열 안정성을 증가시키는 단계를 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 비활성은 약 37∼약 95℃의 온도에서 열 안정성이거나 열 내성일 수 있다.
본 발명은 재조합 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 폴리펩티드를 세포 내에서 과발현시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 핵산을 포함하는 핵산이나 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 서열의 상동성은 서열 비교 알고리즘을 이용하는 분석법 또는 시각적 조사에 의해 측정되고, 과발현은 고활성 프로모터, 이시스트론성 벡터(dicistronic vector) 또는 벡터의 유전자 증폭법에 의해 이루어진다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 트랜스제닉 식물을 제조하는 방법을 제공한다: (a) 이종 핵산 서열을 세포에 도입하여[여기서, 상기 이종 핵산 서열은 본 발명의 핵산 서열을 포함함], 형질전환된 식물 세포를 생산하는 단계; 및 (b) 형질전환된 세포로부터 트랜스제닉 식물을 생산하는 단계. 하나의 측면에서, 상기 단계 (a)는 식물 세포 원형질체를 전기 천공시키거나 미세 주입하여 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 단계 (a)는 또한 DNA 입자 충격법(DNA particle bombardment)에 의해 식물의 조직에 이종 핵산을 직접 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 단계 (a)는 아그로박테리움 튜메페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주를 이용하여 식물 세포 DNA에 이종 핵산 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 식물 세포는 사탕수수, 비트, 대두, 토마토, 감자, 옥수수, 쌀, 밀, 담배 또는 보리 세포일 수 있다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 식물 세포 내에서 이종 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다: (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산 서열로 식물 세포를 형질전환시키는 단계[여기서, 상기 이종 핵산 서열은 본 발명의 핵산을 포함함]; (b) 상기 이종 핵산 서열이 식물 세포 내에서 발현되는 조건 하에서 식물을 생육시키는 단계. 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는, 이종 핵산 서열을 식물 세포 내에서 발현시키는 방법을 제공한다: (a) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산 서열로 식물 세포를 형질전환시키는 단계[여기서, 상기 이종 핵산 서열은 본 발명의 서열을 포함함]; (b) 상기 이종 핵산 서열이 식물 세포 내에서 발현되는 조건 하에서 식물 세포를 생육시키는 단계.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 사료 또는 식품을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 식품, 사료, 액체 예를 들어, 음료(예를 들어, 과일 쥬스 또는 맥주), 빵 또는 가루 반죽이나 빵 제품, 또는 음료 전구 물질(예를 들어, 맥아즙)을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 예를 들어, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 동물용 식품 또는 영양 보충제를 제공한다.
하나의 측면에서, 상기 식품 또는 영양 보충제 중에 포함된 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 예를 들어, 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 식용 효소 전달 매트릭스를 제공한다. 하나의 측면에서, 상기 전달 매트릭스는 펠릿을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 열 내성이다. 다른 측면에서, 상기 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성은 열 안정성이다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 식품, 사료 또는 영양 보충제를 제공한다. 본 발명은 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 동물 식이의 영양 보충제로서 사용하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 본 발명의 폴리펩티드를 이루는 아미노산 중 30개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 함유하는 영양 보충제를 제조하는 단계; 및 동물에 이 영양 보충제를 투여하는 단계. 상기 동물은 인간, 반추위 동물 또는 단위 동물일 수 있다. 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소는 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 진균 및 동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체 내에서 셀룰라제, 예를 들어 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 유기체는 에스. 폼베(S.pombe), 에스. 세레비지아에(S.cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 이. 콜라이(E.coli), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.), 바실러스 종(Bacillus sp.) 및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 열 안정성 재조합 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 식용 효소 전달 매트릭스를 제공한다. 본 발명은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 보조제를 동물에 전달하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 과립형 식용 담체와 열 안정성 재조합 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 포함하는 펠릿 형태의 식용 효소 전달 매트릭스를 제조하는 단계[여기서, 상기 펠릿은 이에 함유되어 있는 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 수성 매질에 용이하게 분산시킴]; 및 이 식용 효소 전달 매트릭스를 동물에 투여하는 단계. 상기 재조합 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소는 글리코실화되어, 펠릿화 조건에서 열 안정성을 가질 수 있다. 상기 전달 매트릭스는 곡물 배아와 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소를 포함하는 혼합물을 펠릿화함으로써 생산될 수 있다. 상기 펠릿화 조건은 증기 처리를 포함할 수 있다. 상기 펠릿화 조건은 약 5분 동안 약 80℃ 이상의 온도로 유지시키는 것을 포함할 수 있으며, 이때 상기 효소는, 효소 1 ㎎당 350∼약 900 유닛의 비활성을 갖는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소, 또는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 약학 조성물은 소화 보조제로서 작용한다.
임의의 측면에서, 셀룰라제-함유 화합물은 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소 활성을 보유하는 본 발명의 폴리펩티드와 pH 약 3.0∼9.0, 10.0 또는 11.0 이상에서 접촉하게 된다. 다른 측면에서, 셀룰로스 함유 화합물은 온도 약 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃ 또는 90℃ 이상에서 셀룰라제 예를 들어, 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 만난아제 및/또는 베타-글루코시다제 효소와 접촉하게 된다.
본 발명의 하나 이상의 측면에 관한 상세한 설명은 이하 첨부된 도면과 상세한 설명에 제시되어 있다. 기타 본 발명의 특징, 목적 및 이점들은 이하 상세한 설명, 도면 그리고 청구항으로부터 분명히 알 수 있을 것이다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원, GenBank 서열 및 ATCC 기탁 번호는 총체적인 목적을 위해 참고용으로 인용되어 있음을 분명히 하고자 한다.
지시문 (instruction)
주어진 원문을 읽고 필요한 정보를 파악하여, 원문에 근거해 질문에 답하라.
질문 (question)
셀룰로스를 글루코스로 완전히 분해하기 위해 필요한 세 가지 효소의 종류는 무엇인가?
추론 과정 (compact_reasoning)
-
1과제 해석
task_interpretation셀룰로스의 완전한 분해에 필요한 효소 구성 요소들을 찾는 질문이다.
-
2정보 추출
information_extraction문맥에서 셀룰로스 분해와 관련된 효소들을 나열한 부분을 탐색한다.
- 상기 3가지 효소들 모두는 셀룰로스를 글루코스로 완전히 분해하는데에 필요한 효소이다.
-
3근거 선택
evidence_selection완전 분해에 필요한 3가지 효소의 명칭을 구체적으로 확인한다.
- 엔도글루카나제(EG)
- 셀로바이오하이드롤라제(CBH)
- β-글루코시다제(BG)
-
4논리 통합
logical_integration추출된 세 가지 효소(EG, CBH, BG)가 셀룰로스 분해 시스템을 구성하는 핵심 요소임을 확인한다.
-
5결론 도출
conclusion_formulation질문에서 요구하는 세 가지 효소의 이름을 정리한다.
-
6답변 생성
answer_generation리스트 형식으로 최종 답변을 작성한다.
최종 답변 (final_answer)
엔도글루카나제(EG), 셀로바이오하이드롤라제(CBH), β-글루코시다제(BG)
핵심 해석 (core_interpretation)
셀룰로스는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 및 베타-글루코시다제를 포함하는 3가지 효소에 의해 글루코스로 완전히 분해된다.