신규한 항-ＰＬＧＦ 항체 document_id A220623054059

비정상적인 혈관 형성은 발병률과 사망률이 높은 수 많은 질환의 발병 기전에 일조한다. 혈관 성장을 진행하고 있는 기전을 밝혀냄으로써, 허혈성 조직에서의 혈관 성장을 자극하거나 또는 종양에서의 그들의 형성을 저해하는 치료 전략을 개발할 수도 있다. 최근에 배아에서의 유전자 표적화 연구 결과, 내피 채널의 초기 형성 (혈관형성)과, 평활근 세포와 망라한 그들의 후속 성숙 (동맥형성)에 관여하는 기전 일부를 확인하였다. 별개의 분자상 기전이 병적 상태 동안 혈관의 성장을 매개할 수도 있다는 명백한 증거가 대두되고 있지만, 이러한 분자 플레이어는 대개 여전히 결정되지 않고 있다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 혈관계의 성장과 병리학적 성장에 밀접한 영향을 미치는 것으로 확립되었다 [참고: Ferrara N. et al, 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30]. 더우기, VEGF의 상동체인 태반 성장 인자 (PlGF)가 각종 병적 상태, 예를 들어 허혈성 망막병증, 종양형성, 염증 장애, 및 부종 동안 VEGF의 특이적 조정인자인 것으로 또한 밝혀졌다. PlGF-/- 마우스는 병든 상태에서는 손상된 혈관형성과 동맥형성을 나타내지만 [참고: Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol. 190, 387 - 405], 건강한 정상 상태에서의 생리적 혈관형성은 병에 걸리지 않은 채로 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, PlGF의 억제제는 혈관형성 또는 동맥형성이 해당 질병의 발병성에 일조하는 질환을 치료하는데 상당한 효능이 있다. PlGF에 대한 억제제는 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 인간 PlGF에 대항한 염소 폴리클로날 항체 (공급처: R0026#D pharmaceuticals, Abingdon, UK) 및 치킨 폴리클로날 항체 [참고: Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528]이다. 이들 항체를 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 조직화학 및 면역침전 연구에 사용하고 있다. WO O1/85796에는 종양 형성과 같은 질병을 치료 또는 예방하기 위한 PlGF의 억제제 (모노클로날 항-PlGF 항체 포함)의 용도가 기재되어 있다. 보다 구체적으로 언급하면, 뮤린 PlGF-2가 그의 수용체 Flt-1과 결합하는 것을 완전히 억제시키는 뮤린 모노클로날 항체의 제조가 기재되어 있는데, 이로써 항체 Mab-PL5D11이 가장 효율적인 억제 활성을 지닌 것으로 선별된다. 병리학적 혈관형성의 동물 모델에 상기 항체를 사용하는 것이 기재되어 있다. 동물에서 생성된 항체는 이들을 인간 요법에 사용하는 것이 극도로 제한될 수 있는 특징을 지니고 있다. 외래 단백질로서, 이들은 문헌 [참고: Jaffers et al., 1986 (Transplantation 1986 41:572)]에 교시된 바와 같이 환자에게서 알레르기성 또는 과민성 반응을 유발시키고/시키거나 그들의 치료 효능을 경감 또는 파괴시키는 항-면역글로불린 반응 (마우스 항체의 경우, 이는 인간 항-마우스 항체 또는 HAMA로서 지칭된다)을 유발시킬 수 있다. 이러한 한계점에 역점을 두고 인간 모노클로날 항체를 사용하긴 하였지만, 다량의 인간 항-인간 항체를 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 생성시키는 것이 어려운 것으로 입증되었다. 따라서, 당해 분야에서는 동물의 높은 결합 친화도는 유지시켜 주지만 인간에게서의 면역원성은 저하된 "인간화" 항체, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체를 구축하기 위해 재조합 기술을 사용하여 왔다. 특히, 비-인간 항체의 가변 영역 (V)을 인간 항체의 불변 (C) 영역과 합한 키메라 항체가 제안되었다. 이러한 키메라 면역글로불린을 수득하는 방법이 미국 특허 제5,770,198에 상세히 기재되어 있다. 뮤린 항체의 면역원성을 저하시키기 위한 또다른 시도에서는, 전체 V 도메인이 아닌 단지 상보성 결정 영역 (CDR), 즉 V 영역 중의 초가변성 영역 만을 인간 항체에 이식한다. 이러한 인간화 항체는 CDR-이식된 항체로서 공지되어 있다. 보다 복잡한 항원을 인식하는 CDR-이식된 항체를 구축하면, 본래의 비-인간화 항체 보다 상당히 더 낮은 결합 활성을 지닌 항체가 생성되었다. 수 많은 경우에서, 비-인간 CDR을 인간 항체 주쇄에 단순히 도입하는 것 만으로는 완전한 결합 활성을 유지시키는데 불충분한 것으로 입증되었다. 인간화 항체를 설계하는데 있어 고려될 중요한 아미노산을 확인 (동정)하기 위해서는 관심있는 뮤린 항체의 정교한 컴퓨터 모델이 요구되고 이러한 설계를 위해 일반적인 이론적 지침이 제안되긴 하였지만, 모든 경우에 있어서 관심있는 특별한 비-인간 항체에 맞게 하고 최적화시킨 과정들을 수행해야만 한다. 그 결과로서, 인간 PlGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 최적으로 억제시키는 (모노클로날) 항체가 여전히 필요하다. 더우기, 이러한 항체는 이들이 HAMA를 유발시킬 수 없다는 점에서 (또는 그렇게 할 경향이 낮다는 점에서) 비-면역원성일 필요가 있다. 발명의 요약 본 발명은 PlGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 억제할 수 있고 PlGF에 대해 유도된 신규한 모노클로날 항체 및 그의 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 생체내 병적 상태에서 인간 PlGF를 억제하는 것을 처음으로 입증하였다. 보다 구체적으로 언급하면, 본 발명에 따르는 항체 및 그의 유도체는 생체내 인간 종양 조직의 혈관화와 종양 크기를 저하시킬 수 있다. 본 발명의 항체는 현재 사용되고 있는 VEGF를 표적으로 하는 항혈관형성 요법에 대한 대안으로서, 이들 요법과 연관된 생리적 혈관형성의 억제에 의해 유발된 부작용을 상당히 저하시키는 중요한 이점을 지니고 있다. 본 발명은 본원에서 16D3으로서 지칭된 항체와 동일한 PlGF의 에피토프와 결합하는 항원 결합성 분자, 특히 모노클로날 항체, 그의 단편 또는 유도체 (인간화 항체 및 항체 단편 포함)에 관한 것이다. 본 발명의 첫 번째 목적은 PlGF와 결합할 수 있고 PlGF의 기능을 억제할 수 있는 능력을 지닐 수 있는 신규한 모노클로날 항체, 보다 구체적으로는 그들의 중쇄 가변 영역이 서열 2의 서열을 포함하거나 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하고/하거나 그들의 경쇄 가변 영역이 서열 4의 서열을 포함하거나 또는 CDR 영역 내에서 이러한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체, 예를 들어 항체 16D3 또는 그의 유도체를 제공하는 것이다. 부가적으로 또는 또 다른 한편, 추가 양태에서 본 발명의 항원 결합성 분자는 CDR 영역을 벗어난 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 내에서 서열 2 및 서열 4 각각의 서열과의 서열 동일성이 70％ 이상, 특히 80％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상이다. 본 발명의 특정한 양태에 따르면, 상기 항체가 인간화 항체, 보다 특히 하이브리드 항체, 가장 특히 마우스/인간 하이브리드 항체, 보다 특히 하이브리드 마우스 16D3/인간 IgG1κ 또는 IgG4κ이다. 또 다른 한편, 인간화 항체는 인간 항체의 주쇄 상으로 이식된, PlGF와 결합할 수 있는 본 발명의 마우스 16D3 항체의 CDR 영역을 포함하는 것이다. 본 발명의 추가 양태는 마우스 16D3 항체 또는 그의 유도체의 항원 결합성 단편, 예를 들어 그의 인간화 항체에 관한 것인데, 예를 들면 Fab, Fab' 또는 F(ab')2, 2개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 조합물, 가용성 또는 막-고정된 단일 쇄 가변 영역, 또는 단일 가변 도메인이 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 항원 결합성 단편의 특정 양태에는 16D3 또는 그의 유도체의 2개 이상의 CDR, 또는 보다 특히 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT), 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR를 포함하거나, 또는 이들과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 단편이 포함된다. 본 발명의 특정 양태는 PlGF 활성을 억제할 수 있는 인간화 단일 쇄 가변 단편 (scFvs) 및 마우스 16D3 항체의 scFvs를 제공하는 것에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 서열 24 또는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 PlGF와 결합할 수 있는 CDR 내에서 상기 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 scFvs를 제공한다. 본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주, 보다 특히 16D3 항체를 생산하는 세포주 16D3 뿐만 아니라, 예를 들어 재조합 기술의 결과로서 16D3 또는 그의 단편으로부터 유래된 항원 결합성 분자를 생산할 수 있는 또다른 세포주를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 추가의 목적은 PlGF에 대항한 항체, 즉 16D3 또는 그의 단편 또는 유도체, 보다 특히 16D3의 인간화 버젼 또는 그의 항원 결합성 단편을, 제약상 허용 가능한 담체와 함께 포함하는, 포유류에게서 병적 상태 또는 장애의 (바람직하지 못한) 혈관형성을 예방 또는 치료하기 위한, 또는 골 흡수를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 구체적 양태는 Fab, Fab' 또는 F(ab')2, 가용성 또는 막-고정된 단일 쇄 가변부 또는 단일 가변 도메인으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 16D3 또는 그의 유도체의 항원 결합성 단편을 포함하는 제약 조성물이다. 본 발명의 가장 특정한 양태는 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR, 또는 서열 17 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택된 2개의 상이한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 항원 결합성 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 그의 특정한 양태는 본 발명의 16D3 항체의 scFv, 보다 특히 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR, 또는 서열 17 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택된 2개의 상이한 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 서열을 포함하는 scFv, 예를 들어 서열 24를 포함하는 scFv를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 가장 특히, 본 발명의 제약 조성물은 16D3의 인간화 scFv, 예를 들어 서열 26, 또는 PlGF와 결합할 수 있는 CDR 내에서 상기 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열을 포함하는 인간화 scFv를 포함한다. 본 발명에 따르는 제약 조성물의 또 다른 특정한 양태에서는, 본 발명의 PlGF와 결합할 수 있는 항원 결합성 분자 이외에도, 치료상 유효량의 또 다른 항혈관형성제가 포함된다. 이러한 국면에서 가장 특히, VEGF- 및 bFGF-억제제와 같은 항혈관형성제가 고려되고, 가장 특히는 항-VEGF 항체가 고려된다. 본 발명의 또 다른 목적은 본원에 기재된 PlGF와 결합하는 항체의 항원 결합성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 세포주 16D3에 의해 생산된 16D3의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다. 가장 구체적으로는, 서열 2 및 서열 4의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 고려된다. 부가적으로, 16D3의 2개 이상의 CDR를 포함하는 항원 결합성 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 보다 구체적으로는 서열 17 (GYTFTDYY), 서열 18 (IYPGSGNT); 서열 19 (VRDSPFFDY), 서열 20 (QSLLNSGMRKSF), 서열 21 (WAS) 및 서열 22 (KQSYHLFT)로 이루어진 군 중에서 선택된 2개 이상의 CDR을 코딩하거나, 또는 서열 17 내지 22와의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 2개 이상의 CDR을 포함하는 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 구체적 양태가 서열 1, 3, 5 및 6에 제공된다. 추가의 구체적 양태에는 16D3 및 그의 인간화 버젼의 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 보다 특히 서열 23 및 서열 25의 서열, 및 보다 특히 scFv의 CDR 영역을 코딩하는 영역 내에서 상기 서열과의 서열 동일성이 80％ 이상, 특히 85％ 이상, 보다 특히 90％ 이상, 가장 특히 95％ 이상인 서열이 포함된다. 그러나, 유전자 암호의 중복 결과로서 본 발명의 범위에 해당하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 인지해야 할 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 치료 또는 예방이 필요한 포유류에게, 본 발명의 항체 16D3 또는 그의 항원 결합성 단편 또는 유도체, 가장 특히 본원에 기재된 바와 같은 scFv인 활성 성분의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류에게서 병적 상태의 바람직하지 못한 (또는 병리학적) 혈관형성을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 방법에 특히 적합한 것은 인간화 항체 및 항체 단편, 예를 들어 16D3 또는 그의 유도체의 scFvs이다. 본 발명의 방법의 특정한 양태는 병적 상태, 예를 들어 암, 염증, 안과 질환, 폐 고혈압 및 혈관 누출 등을 치료 및/또는 예방하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 목적은 포유류, 보다 특히 인간에게서 병리학적 혈관형성, 보다 특히 종양 성장, 염증, 안과 질환 또는 혈관 누출에 대한 유효하고도 안전한 요법 (즉, 부작용이 없음)을 제공하는 것이다. 가장 특히 본 발명의 방법은 고형 종양, 보다 특히 결장암, 유방암, 췌장암 및 흑색종을 치료 및/또는 예방하는데 적합하다. 본 발명의 항체 및 항원 결합성 단편의 추가의 용도는 인간 샘플 중에서의 PlGF를 면역학적으로 탐지하고, 진단 방법에서 표지된 표적화 부분으로서, 및 암을 치료하는데 있어서 PlGF 억제에 대한 부가 효과를 지닌 화합물을 스크리닝하기 위한 것에 관한 것이다. 본 발명은 PlGF를 극히 효율적으로 억제하는 신규한 리간드, 즉 신규한 뮤린 및 인간화 모노클로날 항체, 및 그의 단편, 유도체 및 동족체의 놀라운 결정에 근거한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 종양 성장을 저하시킬 수 있는, 가장 특히 종양 크기를 20％ 내지 50％ 감소시킬 수 있는 리간드를 입증하고 있다.