항-ＧＭ-ＣＳＦ 항체 및 이의 용도 document_id A220623054826

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulation factor), GM-CSF는 원래 조혈 성장 인자로 구분되었다. 이는 림프구, 단핵구, 내피세포, 섬유아세포 및 일부 악성 세포를 포함하는 세포 타입 중의 하나에 의해 생산된다(Metcalf et al., 1986; Clark and Kamen, 1987; Hart et al., 1988; Metcalf et al., 1986). 조혈 전구 세포의 성장 촉진 및 분화의 기능을 가지는 것에 추가로 GM-CSF는 GM-CSF 수용체를 발현하는 면역 시스템의 세포에서 다양한 역할을 하는 것으로 확인되었다(참조: Hamilton, 2002; de Groot et al., 1998). 이러한 기능 중에서 가장 중요한 것은 몇 가지 면역 과정 및 염증 과정에서 단핵구, 대식세포 및 과립구가 활성화되는 것이다(Gasson et al., 1990b; Gasson et al., 1990a; Hart et al., 1988; Rapoport et al., 1992). 성숙 GM-CSF는 2개의 글리코실화 위치를 가진 127개 아미노산으로 이루어진 단량체 단백질이다. 다양한 글리코실화의 결과는 14kDa 내지 35kDa 범위의 분자량이다. 비-글리코실화 및 글리코실화 GM-CSF는 시험관 내에서 유사한 활성을 보인다(Cebon et al., 1990). GM-CSF의 결정학적 분석에서는 4개의 짧은 알파 헬릭스로 구성된 통모양 구조를 보여주었다(Diederichs et al., 1991). 전체적인 접힘은 성장 호르몬, 인터루킨-2 및 인터루킨-4와 같은 다른 성장 인자와 유사하다. GM-CSF는 이의 수용체에 결합함으로써 이의 생물학적 활성을 나타낸다(Kastelein and Shanafelt, 1992; Sisson and Dinarello, 1988). GM-CSF 수용체 (GM-CSF-R) 발현의 가장 중요한 부위는 골수 세포 및 내피 세포의 세포 표면에 있으나, 림프구는 GM-CSF-R 음성이다. 원래 수용체는 최소 2개의 서브유니트, 알파 및 베타로 구성된다. 알파 서브유니트는 리간드 특이성을 부여하며 나노몰 농도의 친화도로 GM-CSF에 결합한다(Gearing et al., 1989; Gasson et al., 1986). 또한, 베타 서브유니트는 인터루킨-3과 인터루킨-5 수용체 복합체의 일부이며, GM-CSF 수용체 알파 서브유니트 및 GM-CSF와 결합하여, 피코몰 농도의 결합 친화도를 가진 복합체의 형성을 유도한다(Hayashida et al., 1990). 수용체에 대한 GM-CSF 상의 결합 도메인이 매핑되었다: GM-CSF는 GM-CSF의 첫번째 알파 헬릭스에 있는 매우 제한된 부위를 통해 이의 수용체의 베타 서브유니트와 작용한다(Shanafelt et al., 1991b; Shanafelt et al., 1991a; Lopez et al., 1991). 알파 서브유니트에 대한 결합은 3번째 알파 헬릭스, 헬릭스 C, 헬릭스 C 및 D와 결합한 루프의 시작 부위 및 GM-CSF의 카르복시 말단에 대해 매핑될 수 있다(Brown et al., 1994). GM-CSF 삼량체(trimer) 수용체 복합체의 형성은 JAK/STAT 패밀리, Shc, Ras, Raf, MAP 키나아제, 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 및 NFkB 분자와 관계된 복합체 신호 전달의 활성화를 유도하며, 결국에는 c-myc, c-fos 및 c-jun의 전사를 유도한다. 활성화는 수용체의 베타 서브유니트에 의해 주로 유도된다(Hayashida et al., 1990; Kitamura et al., 1991; Sato et al., 1993). 또한, 공유된 베타 서브유니트는 IL-3, IL-5 및 GM-CSF에 의해 유발되는 오버래핑 기능에 필요하다(참조: de Groot et al., 1998). 이의 조혈세포 성장 및 분화 촉진 활성을 차치하더라도 GM-CSF는 특히 전염증성 사이토카인으로서 기능을 한다. 대식세포 및 단핵구 뿐만 아니라 호중구 (neutrophils) 및 호산구 (eosinophils)는 GM-CSF에 의해 활성화되며, 그 결과 다른 사이토카인 및 케모카인, 매트릭스 분해 프로테아제를 분비하고, HLA 발현 및 CC-케모카인에 대한 세포 부착 분자 또는 수용체의 발현을 증가시킨다. 상기 후자는 염증이 일어난 조직으로의 염증성 세포의 증가된 화학주성을 유도한다(Chantry et al., 1990; Hamilton, 2002; Sisson and Dinarello, 1988; Zhang et al., 1998; Hamilton et al., 1993; Lopez et al., 1986; Cheng et al., 2001; Gomez-Cambronero et al., 2003). 종종, GM-CSF는 다른 사이토카인 또는 LPS와 같은 다른 염증 자극 인자와 함께 상승적인 작용을 하며, 즉, GM-CSF 처리된 호중구와 LPS를 혼합하면 증가된 산화적 버스트(burst)를 보일 것이다(Kaufman et al., 1989; Rapoport et al., 1992). 항-염증 치료를 위한 타겟으로서의 GM-CSF: 면역 시스템에서의 다양한 활성화 기능으로 인해, GM-CSF는 항-염증 치료를 위한 타겟으로 간주될 수 있다. 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 크론씨 병(Crohn's disease), 건선, 천식, 아토피 피부염 또는 쇼크와 같은 만성 및 급성 염증성 질환은 GM-CSF 활성을 차단하고 GM-CSF 반응 세포의 위험한 활성을 실질적으로 감소시킴으로써 좋은 이점을 얻을 수 있을 것이다(Hamilton, 1993; Zhang et al., 1998; Hamilton, 2002). 관절염(Arthritis): 몇몇 그룹에서는 GM-CSF 뿐만 아니라 이의 수용체가 관절염 환자의 윤활 관절에 존재하는 것으로 나타났다(Alvaro-Gracia et al., 1991; Xu et al., 1989; Haworth et al., 1991). 추가로, GM-CSF는 펠티 증후군(Felty's syndrome)에서 나타나는 호중성백혈구감소증 (neutrophenia)을 치료하기 위해 GM-CSF로 처치하거나(Hazenberg et al., 1989) 화학치료법을 수행하고 난 뒤(de Vries et al., 1991)의 환자에서 류마티스 관절염의 발적을 유발하는 것으로 나타났다. 관절염을 치료하기 위한 GM-CSF 블로킹 항체의 유용성에 대한 첫번째 힌트는 생쥐 생체 내 실험으로부터 얻을 수 있다(Campbell et al., 1997; Campbell et al., 1998; Cook et al., 2001). 특히, 쿡 등의 문헌에서는 GM-CSF에 대한 중화 항체가 콜라겐-유도 관절염 모델에서 효과를 나타냄을 보여주었다. GM-CSF 블로킹은 심각한 염증 관련 질환, 연골 파괴 및 초기에 영향을 받은 팔다리에서의 질병의 진행 또는 다른 팔다리로의 진행의 감소를 유도한다. 류마티스 관절염 또는 다른 염증성 질환을 가진 환자에서 얻을 수 있는 항-GM-CSF 치료법의 몇가지 효과는 장점이 될 것이다. GM-CSF 블로킹은 다음을 억제 또는 감소시키는 것으로 예측된다: a) 성숙 단핵구, 대식세포 및 호중구의 활성 및 개수. 특히, 호중구 및 대식세포는 윤활액 및 윤활막에 풍부하다. 윤활막 내의 대식세포의 수는 RA 관절에 있는 진무름의 정도와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(Mulherin et al., 1996; Burmester et al., 1997). 대식세포는 다양한 다른 전염증성 사이토카인 및 매트릭스 분해 프로테아제의 근원이다. 호중구에 의한 H2O2의 생산은 류마티스성 관절에서 일어나는 파괴적 과정의 일부이다(Babior, 2000). b) 골수 수지상 세포(DCs)의 분화 및 윤활 DCs(=synoviocytes)의 활성화. GM-CSF는 DCs 및 RA 윤활세포 상의 HLA 클래스 II 발현을 유지하고 상향 조절한다(Alvaro-Gracia JM et al., 1991). DCs는 염증성 T-세포의 선택적 활성화와 연관된 기능을 얻기 위해 관절 내에서 생산된다. 특정 HLA-DR 대립형질은 RA에 감염되기 쉽도록 링크되었으며, DC의 항원 전달을 통한 T 세포의 활성화는 이런 타입의 면역 질환에서 중요한 역할을 할 것이다(Santiago-Schwarz et al., 2001). 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis): 다발성 경화증에서, GM-CSF의 증가된 레벨은 MS의 활성기와 관련이 있으며(Carrieri et al., 1998; McQualter et al., 2001) GM-CSF-/- 생쥐는 MS, 실험 뇌척수염, EAE에 대한 모델 시스템에서 질병으로 발전하는데 실패한다(McQualter et al., 2001). 천식 (Asthma): 천식에서, 폐에는 GM-CSF의 양이 증가한 것으로 보고되었다(Broide and Firestein, 1991). 동시에, 호산구가 증가되어 있으며, 여기서 GM-CSF는 인터루킨-5와 함께 다음의 3가지 방식으로 상승적인 작용을 한다: i) 원종 세포로부터 호산구로의 분화를 촉진, ii) 이들의 기능적 활성화를 촉진, iii) 폐에 있는 호산구의 생존을 연장(Broide et al., 1992; Yamashita et al., 2002). 따라서, GM-CSF를 블로킹시킴으로서 천식 기도에 있는 호산구의 생존을 감소시키는 것은 질병을 개선시키는 것과도 같다. 항-GM-CSF 중화 항체의 용도는 생쥐 천식 모델에서 추가로 확인되었으며, 여기서 이러한 항체의 투여는 기도 과민반응 및 기도 염증의 유의적인 감소를 유발하였다(Yamashita et al., 2002). 다른 생쥐 모델에서, 폐의 LPS-의존성 염증은 항-GM-CSF 항체 22E9를 생쥐에 적용시킴으로써 감소될 수 있다(Bozinovski et al., 2003) 독성 효과: 파괴된 GM-CSF 유전자에 대한 생쥐 동형접합체는 정상적으로 발생하며, 12주령까지는 주요한 조혈 동요를 보이지 않는다. 대부분의 GM-CSF-결함 생쥐는 외견상 건강하고 생식능력이 있으나, 모두는 콜라겐 번들이 파괴 및 감소되어 파괴된 혈관 세포외 매트릭스로 진행되고, 폐 표면활성제 제거가 손상되고 미생물 병원균에 대한 저항성이 감소되어 비정상적인 폐로 진행된다. 뒤에 기술된 병리증상은 인간의 폐포 단백증(PAP, pulmonary alveolar proteinosis) 질환과 비슷하다. GM-CSF는 성숙 조혈 세포 및 혈액, 골수 및 비장에 있는 이의 전구체의 주요한 타입의 정상적인 레벨을 유지시키기 위해 필수적인 것으로 보이지는 않는다. 그러나, 이들은 정상 혈관 발생, 폐 기능 및 국소 감염에 대한 저항을 위해서 필수적인 GM-CSF를 포함한다(Stanley et al., 1994; Dranoff et al., 1994; Plenz et al., 2003; Shibata et al., 2001). 최근에, GM-CSF에 대한 자가 항체와 PAP의 강한 결합은 인간의 PAP 발병에서의 GM-CSF 신호 비정상을 추가로 함축한다. 이와 함께, 이러한 관찰은 GM-CSF가 인간의 표면활성 항상성 및 폐포 대식세포 선천성 면역 기능의 조절에 있어서 결정적인 역할을 함을 증명해준다(Bonfield et al., 2002; Trapnell and Whitsett, 2002; Uchida et al., 2004; Kitamura et al., 1999). GM-CSF에 대한 블로킹 활성을 가진 자가항체의 높은 역가는 중증 근육무력증 환자에서 확인되었다. 이 환자들은 어떠한 다른 자가면역 증상 또는 조혈적 결함 또는 "다른 명백한 임상적 관련성"도 보이지 않았다(Meager et al., 1999). GM-CSF의 변형된 형태로서 GM-CSF의 기능을 중화하는 화합물 E21R은 임상 1기 안전성 실험에서 평가되었으며, 암 환자에서 우수한 안전성 프로파일을 가지는 것으로 확인되었다(Olver et al., 2002). 따라서, 긴밀하게 모니터 되어야 하는 폐 기능은 별도로 하더라도, 항-GM-CSF 치료법을 적용할 때에 다른 부작용이 예측되지 않는다. 여태까지는, GM-CSF 중화 기능을 가진 비-인간 종으로부터 유도된 항체만이 생산되었다. 예를 들어, EP 0499161 A1에서는 GM-CSF로부터 유도된 서열인 올리고펩타이드를 이용하여 생쥐를 면역유도시킴으로써 항체가 생성된다고 기술한다. 더불어, 상기 특허 문헌에서는 GM-CSF의 바람직하지 않은 영향을 받고 있는 동물의 증상을 완화시키는 방법을 기술하며, 이 방법은 GM-CSF-억제량의 면역글로불린을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 그러나, 상기 항체는 생쥐 항체이기 때문에 인간에 투여하기에는 적합하지 않은 것으로 간주된다. 추가로, WO 03/068920에서는 억제성 키메라 생쥐/인간 IgG1 항체에 대해 기술한다. 비-인간 서열을 포함하는 항체는 인간 환자에서 면역 반응을 유도하기 쉬우며, 치료적 투여를 위해서는 적합하지 않다. 예를 들어, 장기간의 치료가 필요한 질환에서 (즉, 류마티스 관절염, 천식 및 다발성 경화증과 같은 만성 염증성 질환), 비-인간 치료제의 지속적 투여는 심각한 염증 반응을 증가시키며, 인간 항체의 생산은 치료제를 중화시킬 수 있다. 유사하게는, 항-GM-CSF 항체 치료법에 대한 우수한 잠재성의 관점에서, GM-CSF/GM-CSF 수용체 작용을 효율적으로 블로킹하여 높은 친화도를 가진 인간 항- GM-CSF 항체에 대한 높은 요구가 있다. 추가로, 동물-기반의 생체내 모델에서 효능을 테스트하기 위해서는 1 이상의 비-인간 종의 GM-CSF와 교차-반응할 수 있는 1 이상의 항체를 갖는 것이 이점이 있을 것이다. 본 발명은 하기에 기재된 매우 높은 효능이 있는 항- GM-CSF 항체를 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다. 발명의 요약 본 발명의 목적은 GM-CSF/GM-CSF 수용체 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 인간 및 인간화(humanized) 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 인간을 치료하기에 안전한 항체를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 하나 이상의 본 발명의 항체를 이용하여 GM-CSF의 존재와 연관된 질환 또는 및/또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본원에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 인간 GM-CSF에 특이적인 항원-결합 부위를 제공하며, 여기서 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편은, (i) 약 2x105 CHO-K1 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체의 알파 체인과 0.5 ㎍/㎖ 인간 GM-CSF의 결합을, (a) 상기 CHO-K1 세포 상에 발현된 상기 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도가 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도와 유사한 조건 및 (b) 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 농도가 약 5 ㎍/㎖인 조건 하에서, 최소 50% 차단할 수 있고; (ii) 참조 항체 BVD2-21C11 및/또는 참조 항체 MAB215 보다 최소 5배 낮은 IC50 값으로 TF-1 증식 분석 상에서 0.25 ng/㎖ 인간 GM-CSF를 중화할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "TF-1 증식 분석(proliferation assay)"은 실시예 5B에 기술된 바와 같은 분석으로 정의된다. 당업자라면 본 명세서에 제시된 기술에 따라 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포상에 발현된 것과 동일한 농도에서 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인을 발현하는 CHO-K1 세포를 얻을 수 있다. 본 발명은 추가적으로 본원에 기술된 바와 같은 항원-결합 부위를 포함하는 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 작용 단편 항체를 제공한다. 이러한 항체 또는 이의 작용 단편은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 H-CDR3 부위를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있으며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 H-CDR2 부위를 추가로 포함할 수 있을 것이며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 H-CDR1 부위도 포함할 수 있을 것이다. 이러한 항체 또는 이의 작용 단편은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 다양한 중쇄(heavy chain)를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 GM-CSF-특이 항체는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 L-CDR3 부위를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있으며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 L-CDR2 부위를 추가로 포함할 수 있으며; 상기 항원-결합 부위는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 L-CDR1 부위도 포함할 수 있을 것이다. 이러한 항체 또는 이의 작용 단편은 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 다양한 경쇄(light chain)를 포함하는 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 서열의 펩타이드 변이체는 본 발명에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 60 퍼센트의 서열 동일성을 갖고; 및/또는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 49, 50, 51 또는 52로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 80 퍼센트 서열 상동성을 갖는다. 추가로 포함되는 것은 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 60 퍼센트의 서열 동일성을 갖고; 및 또는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 58, 59, 60 또는 61로 표시되는 CDR 부위를 가진 CDR 부위에서 최소 80 퍼센트의 서열 상동성을 가진 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항-GM-CSF 항체이다. 본 발명의 항체는 IgG(예, IgG1)일 수 있으며, 항체 단편은 예를 들어 Fab 또는 scFv일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 단편은 본원에 기술된 하나 이상의 방법에서 작용하는 항원-결합 부위이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 분리된 핵산 서열에 관한 것이며, 이들 각각은 GM-CSF 특이적인 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편을 인코딩할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 44, 45, 46, 47 또는 48을 포함하는 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 다양한 중쇄, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 44, 45, 46, 47 또는 48의 상보 서열에 대해 높은 가혹한 조건하에서 혼성화하는 핵산을 인코딩할 수 있다. 상기 핵산은 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 53, 54, 55, 56 또는 57을 포함하는 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 다양한 중쇄, 또는 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 53, 54, 55, 56 또는 57의 상보 서열에 대해 높은 가혹한 조건하에서 혼성화하는 핵산을 인코딩할 수 있다. 상기 핵산 서열은 인간 GM-CSF에 특이적인 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편을 인코딩할 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 작용 단편은 (i) 약 2x105 CHO-K1 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체의 알파 체인과 0.5 ㎍/㎖ 인간 GM-CSF의 결합을, (a) 상기 CHO-K1 세포 상에 발현된 상기 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도가 약 2x105 CHO-GMRa#11 세포 상에 발현된 인간 GM-CSF 수용체 알파 체인의 농도와 유사한 조건 및 (b) 상기 분리된 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 작용 단편의 농도가 약 5 ㎍/㎖인 조건 하에서 최소 50% 차단할 수 있고; (ii) 참조 항체 BVD2-21C11 및/또는 참조 항체 MAB215 보다 최소 5배 낮은 IC50 값으로 TF-1 증식 분석 상에서 0.25 ng/㎖ 인간 GM-CSF를 중화할 수 있다. 본 발명의 핵산은 재조합체 생산에 적당하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 진핵세포일 수 있다. 본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방적 적용에 사용될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체(또는 항체의 작용 단편) 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 관련된 맥락에서, 본 발명은 바람직하지 않은 GM-CSF 또는 GM-CSF 발현 세포의 존재와 관련된 질환 또는 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게, 본원에 기술되거나 의도된 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 치료학적 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 질환 또는 질병은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론씨 병, 건선, 천식, 아토피 피부염 및 쇼크와 같은 염증성 질환이 될 수 있다. 본 발명의 인간 또는 인간화 항체(및 이의 작용 단편)는 용액 평형 역가분석(SET, solution equilibrium titration), 및/또는 TF1 증식 분석에 의해 결정된 바와 같이, 쥐 및/또는 붉은털원숭이(rhesus, macaca) GM-CSF와 교차-반응성이 있을 수 있다.