인간 인터페론 베타의 정제방법 document_id A220623055554

인간의 인터페론(Interferon, IFN)은 현재 8 종류로 알려져 있으며, 이들은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형의 두 가지로 분류된다. 1형 인터페론은 알파(alpha)-, 베타(beta)-, 카파(kappa)-, 델타(delta)-, 입실론(epsilon)-, 타우(tau)- 및 오메가(omega)-인터페론이 있고(Oritani and Tomiyama, International journal of hematology, 80, 325-331, 2004; Hardy et al., Genomics, 84, 331-345, 2004), 2형 인터페론에는 감마(gamma)-인터페론이 있다(Gray, P. W., Nature, 298, 859-863, 1982). 인터페론 알파는 백혈구나 림프 모세포에서 생산되며, 인터페론 베타는 섬유아세포(fibroblast)에서, 그리고 인터페론 감마는 면역림프구에서 생산된다. 인터페론(IFNs)은 바이러스의 복제를 억제함으로써, 항 바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며, 면역 반응을 조절한다. 이중 인터페론 베타는 바이러스 감염 등에 의한 반응시 생산되는 사이토카인(cytokine)으로, 특히 다발성경화증(multiple sclerosis, MS) 치료제로 사용된다. 다발성 경화증은 뇌와 척수에서 중추신경계 세포의 축삭(Axon)을 싸고 있는 수초(myelin)들의 파괴 등을 수반하는 중추신경계 질환으로서, 다발성 경화증 환자들은 신경전달의 감소 혹은 차단으로 여러 장애를 겪게 되는데, 부위에 따라 운동마비, 언어장애, 의식장애 및 사고장애 등의 증상을 나타내게 된다. 현재 다발성 경화증 치료를 위한 인터페론 베타는 2 종류가 존재하는데, 첫째로 약제용 인터페론 베타 1a는 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하는 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary, CHO)로부터 생산되고, 166개 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 크기가 25 kD인 당화된(glycosylated) 단백질이다. 둘째로 인터페론 베타 1b는 대장균으로부터 생산되는 165개 아미노산 잔기로 구성된 단백질인데, 당이 결여되어 있고, 아미노산 1번 메티오닌(methionine) 잔기가 결여되어 있으며, 17번 시스테인(cysteine) 잔기가 세린(serine)으로 치환되어 있다. 현재 시판되고 있는 인터페론 베타 1a는 레비프(Rebif, Serono사)와 아보넥스(Avonex, Biogen사)가 있으며, 인터페론 베타 1b는 베타세론(Betaseron, Schering사)이 있다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 미생물에서 재조합 단백질을 발현시킬 때, 단백질이 봉입체의 형태로 발현되는 현상은 비록 그 형성 메카니즘에 대한 정보는 한정되어 있지만 많이 알려져 있는 현상이다[Williams, D. C. et al, Science, 215, 687-689(1982)]. 이러한 현상은 미생물에서 이성 단백질(heterogeneous protein)의 발현을 유도할 때뿐만 아니라, 세포질 단백질(cytoplasmic protein)을 발현시키는 경우에도 배양조건에 따라 발생된다고 보고되었다[Cheng, Y. Y., Biochem. Biophys. Res. Commun., 111, 104-111(1983); Bowen, G. A., J. Biol. Chem. 265, 16760-16766(1990)]. 또한 배양 온도를 올려 줌으로써 봉입체의 형성을 증가시킬 수 있음도 보고되어 있다[Schein, C. H. and Noteborn, M., Bio/Technology, 6, 291-294(1988); schein, C. H. Curr. Opinnion Biotechnol., 2, 746-750(1991)]. 그런데, 이와 같이 세포내에서 봉입체 형태로 발현되는 단백질은 원래의 구조를 갖지 못하게 되며, 동시에 활성도 잃어버리게 되므로[Kiefhaber, T., Roudolph et al., Bio/Technology 9, 825-829 (1991)], 박테리아 내에서 세포 내 봉입체 형태로 발현된 인터페론 베타 1b의 정제는 단백질의 3차원 구조를 이루기 위해 봉입체의 용해와 단백질 재 접힘(refolding) 공정을 필수적으로 수반한다. 단백질의 완벽한 용해가 재 접힘 수율에 영향을 미치므로 완전한 용해를 위해서는 일반적으로 요소(urea)와 염산 구아니딘(guanidine-HCl)과 같은 카오트로픽제( chaotropic reagent) 및 SDS(sodium dodecyl sulfate) 등의 음이온성 계면활성제(anionic detergent)를 다량 사용한다. 봉입체 형태의 단백질을 용해시킨 후 다시 단백질의 재 접힘을 시키기 위해서는 단백질 용해제인 카오트로픽제 및 계면활성제를 제거하게 되는데, 이때 비당질화 되어있는 인터페론은 매우 불안정하여 그 소수성에 의한 응집으로 인한 침전이 발생하는 문제가 있다. 봉입체 형태의 인터페론 베타를 용해 및 정제하는 공정에 고농도의 SDS를 사용하는 경우가 많이 있으나, 정제 중 모든 과정에서 포함되는 SDS 때문에 정제 컬럼 사용에 극히 제한을 받는다는 한계가 있고, SDS의 제거가 용이하지 않은 단점이 있다. 이런 한계를 극복하기 위하여 양쪽성 이온성 계면활성제(zwitterionic detergent)를 용해도 증가 및 여러 종류의 컬럼 정제를 동시에 가능하도록 사용하기도 하였으나(DEAN R. H., J. I 0026# C. Res., 15:31-37 (1995)), 컬럼 정제의 한계는 극복이 가능하였던 반면, 재 접힘의 효율 및 순도가 저하되는 단점이 있었다. 이러한 기존의 재 접힘과 정제의 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자는 양이온 교환 수지에 단백질을 흡착시키고, 단백질이 흡착된 상태에서 양쪽성 이온성 계면활성제의 농도를 낮추어 침전을 줄이고 추가로 산화제를 첨가하여 재접힘을 유도하였으며, 이로 인하여 기존의 대장균 유래의 인터페론 베타 정제 공정의 재접힘 수율 감소와 컬럼 공정 선택의 한계를 동시에 극복하고, 기존 공정의 문제점을 해결할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.