결핵 예방용 조성물 document_id A220623055990

전세계 인구의 1/3(약 19억명)이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 감염되어 있으며, 매년 약 800만명 내지 1,000만명의 새로운 환자가 발생하고 있고, 연간 약 300만명이 결핵으로 사망하는 것으로 추정되고 있다. 최근에는 AIDS 환자에게서 결핵의 발병률이 높은 것으로 나타나, AIDS 가 결핵의 새로운 유포원으로 알려지고 있어 그 심각성이 더해지고 있다. 선진국에서도 HIV 감염의 확산으로 결핵환자가 확산되고 있는 추세이다. 결핵으로 인한 사망률은 90년대 이후 다시 증가하고 있으며, 이는 다약제내성 결핵균에 의한 감염 증가와 HIV 감염 확산으로 인한 결핵 빈도 증가가 주원인으로 판단되고 있다. 현재 전 세계적으로 약 5000 만명의 다약제내성 결핵(multi-drug resistant tuberculosis; MDR-TB) 환자가 있지만, 이에 대한 치료효율은 50% 정도 밖에 되지 않는다. 또한, 현재 전 세계적으로 약 600 만명의 HIV/TB 동시 감염환자가 있으며 대부분이 결핵환자로 이환되어 사망하는 것으로 추정되고 있다. 결핵균은 증식속도가 매우 느린 막대 모양의 간균으로 건조상태, 강산 또는 알칼리에도 잘 견디는 항산성균이다. 결핵의 감염경로는 결핵환자의 객담 방울 속에 섞여 나온 균이 공기 중에 떠다니다가 숨을 쉴 때 들여 마셔 폐 속에 들어가 감염되는 것이다. 대부분은 자연 치유되지만 감염자 중 5-10%는 결핵환자로 발전하여 과로, 영양부족, 당뇨병 등과 같은 합병증으로 몸의 면역력이 떨어졌을 때 발병하게 된다(Kochi et al., Lancet 1997, 350:142; Toossi and Ellner, Pathogenesis of tuberculosis. In: Friedman LN (ed). Tuberculosis: current concepts and treatment. CRC Press: New York, 2001, pp.19-47). 따라서, 결핵에 감염되지 않거나 결핵에 감염된 사람을 보호하는 예방용 및 치료용 백신을 개발하는 것은 매우 중요한 일이다. BCG(bacillus Calmette-Gurin)는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)라는 세균의 병독성을 약화시킨 약독화 생백신으로 전세계적으로 가장 많이 사용되고 있으며, 널리 퍼져 있는 결핵으로부터 어린이들을 보호하는데 효과적이다. 그러나 그 지속기간이 유년기까지로 한정되어 있으며, 성인에게는 치료 효능이 거의 없는 것으로 알려져 있다. 따라서, BCG의 단점을 극복할 수 있는 효과적이고 장기적으로 결핵을 예방할 수 있는 백신의 개발이 요구된다. 본 발명에서는 양성대조군의 하나로써 BCG를 사용하였다. 현재까지 새로운 예방용 결핵 백신으로 DNA 백신이 시도되어 왔고, 동물 모델에서 그 효능을 많이 증명하였다. 또한 많은 결핵 항원이 DNA 백신 기법을 이용해서 발굴되어 왔다. DNA 예방접종은 생쥐 및 인간에서 효과적인 항-마이코박테리아 면역성(anti-mycobacterial immunity)을 획득하는데 필수적이라고 알려진 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 및 Th1 반응을 포함한 세포 면역 반응을 확립하는데 매우 효과적임이 증명되었다(Bonato VL et al., Infect Immun, 1998, 66: 169-175). 이렇듯 효율적인 면역화 기법의 도입에, 적합한 항원 선정의 중요성으로 인하여, 항원 발굴 또한 활발히 진행되어 왔다. 예를 들어, 항원 85A, 85B, 65 kDa 열충격단백질(heat shock protein) 또는 PstS-3을 발현하는 예방용 DNA 백신은 생쥐에서 M. 투베르클로시스의 성장을 제한하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다(Denis O et al. Infect Immun 66: 1527-1533, 1998; Huygen K et al. Nat Med 1996; 2: 893-898; Lozes E et al. Vaccine 15: 830-833, 1997; Kamath AT et al. Infect Immun 67: 1702-1707, 1999; Tascon RE et al. Nat Med 2: 888-892, 1996; Lowrie DB et al. Vaccine 15: 834-838, 1997; Tanghe A et al. J Immunol 162: 1113-1119, 1999). 현재, 많은 동물 및 임상 모델에서 단일 항원으로 가장 그 효능을 안정적으로 인정받는 것은 Ag85A이다 (Philip O et al, Nature review microbiology. 2: 930-932, 2004). 따라서 본 발명에서는 단일 항원에 대한 양성 대조군으로 Ag85A를 사용하였다. 한편, 최근에는, 단일 항원으로 이용이 불가능하거나 효능을 보지 못하는 항원을 다른 항원과 융합하여 사용하는 경우가 있는데, 그 예로 Ag85B-ESAT6 융합 항원이 잘 알려져 있다 (Delphine Cendron et al, Eur. J. Immunol. 2007. 37: 549565). Mtb32A는 세린 단백질 분해효소(Serine protease)로서, Mtb32A 역시 항원 단백질 고유의 특성으로 인하여 단백질로 분리, 정제되기 힘들다는 이유로 지금까지 다른 항원과 결합된 형태로 이용되어 왔으며(Yasir A. W. Skeiky et al, INFECTION AND IMMUNITY, 67: 3998-4007, 1999), 그 예로 M72F (Mtb32A항원의 N 말단-Mtb39 항원-Mtb32A항원의 C 말단) 융합 항원이 잘 알려져 있다 (Yasir A. W. Skeiky et al, JI 172;7618-7628, 2004). 그러나 이러한 융합 항원은 단일 항원의 효용성이 떨어지는 것을 보충하거나(Ag85B-ESAT6), 단일 항원으로써 그 이용이 불가능할 경우에 대신하여 이용하는 것으로써(M72F의 Mtb32A) 차선책으로 선정된 것이다. 또한, 이러한 제한적인 항원의 이용은 언제나 부수적인 항원에 대한 검증을 같이 요구하므로 경제적이지 못하며, 단일 항원 자체에 의한 면역학적, 병리학적 연구 또한 효율적이지 못하다. 이러한 배경 하에, 본 발명자들은 보다 효과적인 결핵 예방용 백신 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 유전자 개량기술을 이용해서 최초로 Mtb32A 단일 항원에 의한 결핵 면역원성 유도 및 방어효능을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 Mtb32A 효소 활성화에 요구되는 세 개의 아미노산을 치환함으로써 그 활성을 무력화시킨 돌연변이체가 단일 항원으로도 그 발현량이 안정적이며, 강한 면역원성을 유도하고, 또한 결핵균 동물모델에서 그 예방효과 역시 뛰어남을 증명하였다. 나아가, 본 발명자들은 항원의 강하고 지속적인 면역반응의 형성을 위하여 면역반응을 증가시킬 수 있는 항원 엔지니어링 기술을 도입하여 면역 세포간 상호 활성분자(costimulatory molecule)인 Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)를 Mtb32A 활성부위 돌연변이체에 융합하여 최적의 결핵 예방을 위한 면역 조성물을 제조하였고, 이를 쥐 모델에서 실험한 결과, Mtb32A 특이적 항체 반응 및 CTL 세포증식반응 등의 면역 반응이 증가하며 결핵의 예방 및 치료 활성이 예측하지 못한 수준으로 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.