테트라히드로비오테린의 선택적 정량분석 방법 document_id A220623056601

테트라히드로비오테린(tetrahydrobiopterin)은 방향족 아미노산 수산화효소들(aromatic amino acid hydroxylases)의 조효소로서 다양한 질환과 관련된다(Kaufman S 0026# Fisher DB. (1974) Pterin-requiring aromatic amino acid hydroxylases. In: Hayaishi O, edMolecular Mechanisms of Oxygen Activation. New York: Academic Press pp 285369). 대표적인 질환은 비정형성 페닐케톤뇨증(atypical phenylketonuria, PKU)이다. 이는 유전적으로 테트라히드로비오테린 생합성에 결함이 있는 신생아들에서 페닐알라닌 수산화효소(phenylalanine hydroxylase)가 제대로 기능을 발휘하지 못하여 혈액 내 페닐알라닌의 농도가 증가하는 질환이다 (Nichol CA, Smith GK, Duch DS. (1985) Biosynthesis and metabolism of tetrahydrobiopterin and molybdopterin. Annu Rev Biochem. 54:729764; Duch DS, Smith GK (1991) Biosynthesis and function of tetrahydrobiopterin. J. Nutr. Biochem., 2: 411-423). 이 환자들은 또한 타이로신과 트립토판 수산화효소의 기능이 저하되어 뇌에서 도파민, 세로토닌과 같은 신경전달물질들의 생합성이 제대로 일어나지 않게 된다. 이외에도 테트라히드로비오테린의 결함은 유전성 신경질환인 도파-반응성 근긴장이상(dopa-responsive dystonia)을 야기시키며(Ichinose H, Ohye T, Takahashi E, et al. (1994) Hereditary progressive dystonia with marked diurnal fluctuation caused by mutation in the GTP cyclohydrolase I gene. Nat Genet 8:236-241), 파킨슨 질환과도 연관이 있는 것으로 밝혀지고 있다. 또한 알츠하이머 질환, 우울증 환자들에서 체액 내 테트라히드로비오테린의 농도가 정상인보다 낮은 것으로 알려져 있으며, 상피세포에서 멜라닌 색소가 결핍되는 백색증환자도 테트라히드로비오테린 생합성의 저하에서 비롯된다 (Schallreuter KU, Zschiesche M 0026# Moore J et al. (1998) In vivo evidence for compromised phenylalanine metabolism in vitiligo. Biochem Biophys Res Commun 243: 395399). 테트라히드로비오테린은 또한 당뇨병, 고혈압, 심근경색, 뇌졸중과 같은 내피혈관세포의 기능장애 (endothelial dysfunction)과 밀접한 연관이 있다. 이는 테트라히드로비오테린이 심혈관 기능에서 중요한 역할을 하는 일산화질소 생합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 조효소이자 조절자로서 중요한 역할을 하기 때문이다(Schmidt TS, Alp NJ (2007) Mechanisms for the role of tetrahydrobiopterin in endothelial function and vascular disease. Clinical Science 113: 47-63; 및 Moens AL, Kass DA (2006) Tetrahydrobiopterin and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: 2439-2444). 이와 같이, 비정형 페닐케톤뇨증, 근긴장이상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 우울증, 백색증, 내피혈관세포 기능장애 등의 다양한 질환의 진단을 위하여는, 환자의 시료 예를 들어 혈액(혈청), 뇌척수액, 기타 조직에서 테트라히드로비오테린을 효율적으로 분석하는 것이 필요하다. 한편, 테트라히드로비오테린은 생체 내에서 테트라히드로(tetrahydro) 상태의 환원된 형태로서 활성을 나타내며, 쉽게 디히드로(dihydro) 또는 완전히 산화된 형태인 비오테린(biopterin)으로 전환된다. 따라서, 생체 내에는 테트라히드로비오테린 및 그의 산화된 형태인 디히드로비오테린(dihydrobiopterin)과 비오테린(biopterin)이 혼재하여 존재한다. 특히 산화스트레스가 주요한 원인으로 알려진 심혈관 질환에서는 테트라히드로비오테린의 산화가 심각한 문제로 대두되고 있다. 최근 심혈관 질환에서는 단순히 테트라히드로비오테린의 농도보다 그의 산화물과의 농도비가 중요하게 취급되고 있다. 즉, 산화 스트레스의 지표로서 테트라히드로비오테린/(디히드로비오테린+비오테린)의 농도비가 중요한 지표로 작용한다(Yada T, Kaji S, Akasaka T, et al. (2007) Changes of asymmetric dimethylarginine, nitric oxide, tetrahydrobiopterin, and oxidative stress in patients with acute myocardial infarction by medical treatments. Clinical Hemorheology and Microcirculation 37: 269-276; 및 Taylor NE, Maier KG, Roman RJ, Cowley AW (2006) NO synthase uncoupling in the kidney of Dahl rats: Role of dihydrobiopterin. Hypertension. 48: 1066-1071). 따라서 생체시료에서 테트라히드로비오테린을 그의 산화물들로부터 구별하여 정량분석하는 것이 중요하다. 생체 시료 중 테트라히드로비오테린의 분석은 그의 산화물이 형광을 가지는 특성에 기초하여 이루어지고 있다. 즉, 테트라히드로비오테린을 산성 요오드 용액으로 산화시켜 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 분리한 후 형광분석기를 통해 정량분석을 수행한다. 그러나, 이러한 분석방법은 테트라히드로비오테린 뿐만 아니라 그의 산화물 즉, 디히드로비오테린 및 비오테린도 함께 분석되기 때문에, 테트라히드로비오테린만을 선택적으로 분석할 수 없는 문제점이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위한 방법으로서, Fukushima T 등은 염기성 요오드 산화를 이용한 분석방법을 개발한 바 있다(Fukushima T, Nixon JC (1980) Analysis of reduced forms of biopterin in biological tissues and fluids. Anal Biochem 102: 176-88). 상기 염기성 산화조건에서 테트라히드로비오테린는 곁사슬이 끊어져 테린(pterin)으로 산화되고 디히드로비오테린은 비오테린으로 산화된다. 그러나, 염기성 요오드 산화를 이용한 분석방법은 산성요오드 산화와는 별도로 시료를 준비하여 두 번에 걸친 HPLC 분석을 실시하여야하고, 테린으로 전환된 양이 비오테린과 일치하지 않는 등의 단점이 있다. 또한, 생체시료를 산화시키지 않은 상태로 HPLC를 수행하여 테트라히드로비오테린과 디히드로비오테린을 분리한 후 전자화학 검출기(electrochemical detector, ECD)를 사용하여 분석하는 방법이 개발된 바 있다(Lunte CE, Kissinger PT (1983) The determination of pterins in biological samples by liquid chromatography/electrochemistry. Anal. Biochem 129: 377-386). 그러나 이 방법은 ECD를 사용한 정량분석의 경우 시료마다 편차가 심하다는 문제를 안고 있다. 이 문제를 해결하고자 HPLC를 통과하여 나오는 시료를 산성요오드 용액으로 산화시켜 형광분석기로 측정하기도 한다(Hyland K (1985) Estimation of tetrahydro, dihydro and fully oxidized pterins by high performance liquid chromatography using sequential electrochemical and fluorometric detection. J Chromatogr. 343(1):3541). 그러나, 이 방법은 별도의 시료처리 장치를 부착하여야하는 문제가 있다. 이러한 문제점 때문에 테트라히드로비오테린을 그의 산화물과 구별하여 정량분석하기가 곤란하며, 또한 동일한 생체시료에서 얻어지는 테트라히드로비오테린의 양도 논문마다 많은 편차를 보이고 있다. 그리고 기존에 알려진 분석방법은 HPLC에만 의존하기 때문에 많은 시료를 분석할 수 없는 한계를 가지고 있다. 하나의 시료를 HPLC로 분석하기 위해서는 한 시간 이상의 전처리 시간을 제외하고 적어도 20분의 시간이 소요된다. 상기한 문제점들 때문에 테트라히드로비오테린이 1 μM 농도 이하의 수준으로 존재하는 생체시료를 포함한 검체로부터 테트라히드로비오테린을 선택적으로 정량분석할 수 있는 방법으로서, 간단하고, 신속하며, 정확한 분석방법을 개발하는 것이 당업계에 요구되고 있다.