미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매 document_id A220623059347

최근 많은 화학 반응에 효소나 전세포 생촉매 이용이 크게 증가하고 있다. 일반적으로 생촉매는 화학촉매에 비해 반응속도가 떨어지는 단점이 있지만 상온 상압의 온화한 조건에서 반응을 진행시키고 반응특이성이 우수하다는 장점이 있다. 특히 효소의 경우 사용의 편리함과 높은 효율성 때문에 광학활성을 갖는 화합물의 유기합성에 많이 사용된다. 하지만 효소정제에 많은 비용이 소요되고 정제과정이나 반응 중 활성이 안정하지 못하다는 단점이 있다. 이에 비해 전세포 생촉매는 정제 비용이 필요 없고, 반응 중 촉매 활성이 비교적 안정적으로 유지된다는 장점이 있다. 또한 조효소가 필요하거나 여러 단계의 반응을 수반하는 공정의 경우에는 전세포를 사용하는 것이 거의 필수적인 것으로 알려져 있다. 산화효소 전세포 생촉매는 공업적으로 특히 중요하다. 산화효소는 탄소-탄소 이중결합에 특이적으로 산소를 도입하여 광학활성 에폭사이드(chiral epoxide)를 만든다. 에폭사이드는 환형구조의 불안정성과 산소 원자의 전기음성도에 기인한 극성 때문에 반응성이 대단히 우수하여 친전자성반응, 친핵성반응, 산염기반응, 산화환원반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있다. 이에 따라 광학 활성 에폭사이드는 광학활성 의약품, 농약, 기능성 식품 합성 중간체 등으로 널리 사용된다. 이러한 광학활성 에폭사이드는 산화효소 이외에 에폭사이드 하이드롤라제 (epoxide hydrolase)로도 제조할 수도 있다. 이 경우 에폭사이드의 라세믹 혼합물을 기질로 사용하며 가수분해 속도가 느린 이성질체를 최종 제품으로 얻게 된다. 산화효소와 비교할 때 효소반응 자체는 간단하지만 원료 대비 최종 제품의 수율이 50 % 이하로 낮고 또한 최종 제품의 순도도 떨어진다는 단점이 있다. 여러 산화 효소 중 스티렌 산화효소(styrene monooxygenase, SMO)는 스티렌을 광학활성 스티렌옥사이드로 전환하는 효소이다. 광학활성 스티렌옥사이드는 네마토시드(nematocide), 레바미솔(levamisole) 등 항암제나 β-차단제인 고혈압 치료제와 같은 의약품, 그리고 다양한 고부가가치 정밀화학제품의 중간체 생산의 원료로 사용될 수 있다. 스티렌 산화반응은 다른 산화효소 반응과 마찬가지로 산소와 기질, 그리고 복합 효소가 관여하는 복잡한 반응이다. 또한 NADH와 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide; FAD)와 같은 조효소가 필수적으로 요구된다. 따라서 SMO의 경우 정제된 효소 생촉매를 사용하는 것보다 전세포 생촉매를 사용하는 것이 더 유리하다. 스티렌 산화효소는 StyA 및 StyB 두 개의 단위체로 구성되어 있다. 이 두 단위체는 안정적이면서 활성이 있는 형태로, 그리고 이상적인 비율로 발현되어야 하기 때문에 발현의 최적화가 매우 어렵다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 멀티시스트론(multicistronic) 발현 벡터를 이용하거나 프로모터공학이나 단백질공학 등이 필요하다. 그리고 발현된 단백질의 재접힘 능력을 향상시켜서 활성이 있는 상태로 단백질을 축적하거나 분비 발현이 가능하도록 하는 재조합 균주의 개발이 시도되고 있는데 그 대표적인 사례가 샤페론 단백질의 도입이다. 샤페론 단백질은 단백질이 입체적 구조를 갖도록 도와주는 단백질을 말한다. 샤페론 단백질은 접힘이 되어있지 않거나 부분적으로만 접힘이 되어 있는 단백질과 결합하여 재접힘 시킴으로써 단백질의 활성이 감소되는 것을 막아주는 역할을 한다. 그리고 고온이나 심한 스트레스와 같은 환경에서 과잉 발현되어 세포를 보호하는 역할을 한다고도 알려져 있다. 단백질의 정확한 접힘은 단백질의 안정성과 생물학적 기능을 결정하고 분비경로에서 어긋나지 않도록 하기 때문에 단백질의 운명결정에 있어 중요한 문제이다. 따라서 특정 단백질의 대량생산에 샤페론을 응용하는 사례가 증가하고 있으며 스티렌 산화효소 전세포 생촉매에 적용 가능함이 입증되었다. 스티렌 산화효소에 의한 스티렌옥사이드 생성반응은 산소와 NADH의 신속한 공급을 위해 호기적인 조건에서 포도당과 같은 탄소원이 다량 공급되는 상태로 진행된다. 따라서 포도당이 해당과정과 TCA 회로를 통해 빠른 속도로 분해되며, NADH 또한 빠른 속도로 생산된다. 그러나 이렇게 생산된 NADH는 SMO 반응에 쓰이기보다는 대부분 전자전달계를 통해 산화되면서 ATP를 생합성하게 된다. 일반적으로 세포의 성장이 활발히 일어날 때는 이러한 ATP 합성이 필수적이다. 그러나 스티렌 산화반응이 목적일 때는 다량의 ATP가 필요치 않으며 전자전달계를 통한 NADH의 과도한 산화는 포도당, 산소 등의 수율을 떨어뜨릴 뿐이다. 특히 산소의 이용 효율은 반응기의 생산성과 밀접한 관계를 가진다. 왜냐하면 산소는 물에 대한 용해도와 기-액 전달 속도가 낮아 반응기 부피 생산성을 결정하기 때문이다. 따라서 NADH의 전자전달계 유입속도를 적절히 조절함으로써 포도당의 이용 효율은 물론 산소 이용효율도 증가시키는 것이 필요하다. 포도당 이용 효율도 SMO 반응의 최적화에 중요한 요소이다. 앞서 언급한대로 이 효율은 NADH의 생성, 전자전달계를 통한 NADH의 산화에 밀접한 관계가 있다. 뿐만 아니라 탄소 대사 경로와도 밀접한 관계를 갖는다. 즉 젖산이나 숙신산, 에탄올, 초산 등이 생성되면 포도당 소모 대비 스티렌 옥사이드의 생성효율이 감소하게 된다. 대장균의 탄소 대사 과정에서 에탄올이나 각종 유기산의 생성은 반응액 내 용존산소의 농도를 높게 유지해 줌으로써 어느 정도 방지할 수 있다. 그러나 포도당의 세포 내 이송속도가 TCA 회로의 최대 허용 운전 속도보다 더 크게 되면 소위 말하는 과유량 대사(overflow metabolism)가 일어나고 초산 등의 생성은 필연적으로 뒤따르게 된다. 이 경우 젖산이나 초산을 생성하는 경로를 끊어 줌으로써 완전하지는 않지만 이를 부분적으로 해결할 수 있다고 알려진다. NADH 대사는 전세포 산화 효소 반응의 포도당 및 산소 이용 효율에 영향을 미칠 뿐 아니라 반응속도(reaction kinetics) 측면에서 전세포의 SMO 활성에도 많은 영향을 미친다. NADH는 스티렌 산화 반응의 기질로 작용하므로 세포 내 NADH 농도는 스티렌, FAD, 산소 등과 함께 반응속도에 직접 영향을 주게 된다. 따라서 NADH 생산 속도를 증가시키거나 이의 전자전달계 유입 속도를 낮추어 줌으로써 세포내 NADH 농도를 증가시킬 경우 전세포 촉매활성도 증가할 수 있다. NADH의 세포내 농도는 앞서 언급한 NADH의 전자전달계 유입을 차단하거나 포도당의 분해가 펜토오스포스페이트(PP) 경로를 통해 일어나게 함으로써 가능하다. 특히 NADH의 전자 전달계 유입 방지조작은 포도당 대비 스티렌 옥사이드 생성 수율, 산소 이용 효율 등을 향상시킬 뿐 아니라 전세포 내 SMO 활성을 증가시킬 수 있을 것이 예상된다. 전세포 SMO 활성에 영향을 주는 또 한 가지 중요한 인자는 기질인 스티렌의 세포 내 유입속도이다. 일반적으로 산화 효소의 기질로 이용되는 작은 소수성 물질들은 확산에 의해 빠르게 세포막으로 전달된다. 그러나 분자의 크기가 크거나 전하를 띠는 물질들은 세포내로 쉽게 들어올 수 없기 때문에 기질의 업테이크(uptake)는 생촉매 반응에 있어 속도결정 단계가 된다. 최근 스티렌을 탄소원으로 이용하는 미생물에 있어서 스티렌 산화 오페론은 스티렌 산화에 관여하는 styABCD 유전자와 함께 스티렌의 세포막 전달 단백질을 코딩하는 styE 유전자를 포함한다는 연구 결과가 보고된 바 있다. 또한 styE를 과발현시킬 경우 스티렌의 업테이크(uptake) 속도가 증가하고 스티렌 농도에 의해 조절되는 슈도모나스(Pseudomnas) 균주의 스티렌 산화 효소 오페론의 발현이 증가된다는 보고가 있었다. 대장균에도 세포막에 물질이동을 촉진하는 여러 단백질이 존재하는데 이중 긴사슬 지방산을 세포내로 전달하는 단백질로 밝혀진 대장균의 FadL 단백질은 StyE와 매우 유사한 유전자 및 아미노산 서열을 가지고 있다. 따라서 StyE나 FadL을 과발현시킴으로써 스티렌 업테이크(uptake) 속도를 증대시키고 이를 통해 전세포 SMO의 활성증대를 기대해 볼 수 있다.