이종 장기 이식용 미니 복제돼지 생산을 위한 유전자 조작된 세포주 및 그의 생산방법 document_id A220623061310

국립장기이식센터에 따르면 국내에서 한해 2만 여명에 달하는 환자들이 장기이식을 기다리고 있으나, 기증 건수는 수요의 10%에도 못 미치는 것으로 보고 되었다. 또한 미국의 경우 장기를 필요로 하는 대기자는 16분에 한명씩 추가 되고 있으나, 하루에 대기자 중 11명은 수술 받지도 못하고 사망하는 실정이다. 이러한 상황과 더불어 생명과학기술의 발달은 이종 장기이식 기술개발의 배경이 된다. 동물 유전학의 꾸준한 진보는 특정 유전자를 제거 또는 삽입함으로써 각 유전자의 역할 규명과 함께 상업적으로 유용한 형질전환 동물 생산을 가능케 하였다. 형질전환된 동물 제조를 위한 방법으로는 미세주입법(microinjection) 또는 바이러스 감염법(viral infection)등을 이용한 무작위적인 유전자 조작법과 배아줄기세포(embrynic stem cells) 또는 체세포(somatic cells)를 이용하여 특정 유전자를 타겟팅 시킬 수 있는 유전자 적중법이 있다. 미세주입법은 외래 DNA를 수정란의 전핵에 삽입하는 고전적인 방법으로 형질전환 동물을 생산하기 위해 널리 이용되어져 왔다(Harbers et al., Nature, 293(5833): 540-2, 1981; Hammer et al., Nature, 315(6021): 680-683, 1985; van Berkel et al., Nat. Biotechnol., 20(5): 484-487, 2002; Damak et al., Biotechnology(NY), 14(2): 185-186, 1996). 그러나 미세주입법으로 외래 DNA가 삽입된 수정란 유래의 형질전환된 산자의 생산 비율은 2 내지 3 % 로 효율이 매우 낮으며(Clark et al., Transgenic Res., 9: 263-275, 2000), 외래 유전자의 삽입 위치의 조절 및 특정 내부 유전자의 제거가 불가능하다. 바이러스감염법 또한 동물의 유전자 조작을 위해 널리 사용된다(Soriano et al., Genes Dev., 1(4): 366-375, 1987; Hirata et al., Cloning Stem Cells, 6(1): 31-36, 2004). 바이러스 감염법은 삽입하고자 하는 유전자가 바이러스 벡터를 통하여 동물의 유전자로 도입되므로 미세주입법보다 좀더 효율적이나, 여전히 특정 위치로의 외래 유전자의 삽입 및 특정 내부 유전자의 제거가 불가능하다. 또한, 삽입 하고자 하는 유전자의 최대 사이즈는 7 kb로 제한되며, 바이러스에 의해 발현되는 단백질이 문제된다(Wei et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 37: 119-141, 1997; Yanez et al., Gene Ther., 5(2): 149-159, 1998). 위에서 언급한 문제점들 극복하기 위해서, 특정 유전자를 제거 또는 삽입할 수 있는 유전자 타겟팅 기술이 이용될 수 있다. 유전자 타겟팅 기술은 마우스 배아 줄기세포를 이용한 유전자 기능 연구에서 처음으로 사용되었다. 상동 재조합을 이용하여 특정 유전자가 타겟팅된 마우스 배아 줄기세포를 배반포 단계에 있는 배아에 삽입함으로써 결국 특정 유전자가 조작된 산자 생산이 가능하게 된다. 이러한 마우스 배아줄기세포에 유전자 타겟팅법을 이용하면서, 많은 수의 특정 유전자 타겟팅된 마우스가 생산되었다(Brandon et al., Curr. Biol., 5(6): 625-634, 1995; Capecchi et al., Science, 244(4910): 1288-1292, 1989; Thompson et al., Cell, 56(2): 313-321, 1989; Hamanaka et al., Hum. Mol. Genet., 9(3): 353-361, 2000; Thomas et al., Cell, 51(3): 503-512, 1987; te Riele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(11): 5182-5132, 1992; Mansour et al., Nature, 336(6197): 348-352, 1988; Luo et al., Oncogene, 20(3): 320-328, 2001). 유전자 타겟팅법이 가축에 적용될 때, 대량의 치료 단백질을 생산하는 동물생체 반응기(animal bioreactor) 또는 면역거부반응에 관여하는 유전자를 제거 또는 특정 위치에서의 과다발현에 의해 이종간 장기이식에 사용될 수 있는 질병 모델 동물 생산이 가능하며, 이는 산업적으로 큰 경제적인 이익을 가져올 것으로 예상되고 있다. 유전자 타겟팅된 동물을 생산하기 위해서, 배아줄기세포의 사용이 필수적인 요소로 여겨져 왔다. 그러나 돼지와 소를 포함한 가축에서 배아줄기세포와 유사한 세포 주들이 보고 되었음에도 불구하고, 현재까지 가축에서 배아 줄기 세포의 사용은 제한된다(Doetschman et al., Dev. Biol., 127(1): 224-227, 1988; Stice et al., Biol. Reprod., 54(1): 100-110, 1996; Sukoyan et al., Mol. Reprod. Dev., 36(2): 148-158, 1993; Iannaccone et al., Dev. Biol., 163(1): 288-292, 1994; Pain et al., Development, 122(8): 2339-2348, 1996; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(17): 7844-7848, 1995; Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev., 6(5): 563-568, 1994). 대신에, 핵 공여 세포로서 일반 체세포가 유전자 타겟팅에 사용될 수 있다는 가능성이 제시되면서, 형질전환된 복제 가축 생산이 가능하게 되었다(Brophy et al., Nat. Biotechnol., 21(2): 157-162, 2003; Cibelli et al., Science, 280(5367): 1256-1258, 1998; Campbell et al., Nature, 380(6569): 64-66, 1996; Akira Onishi et al., Science, 289;1188-1190, 2000 Denning et al., Cloning Stem Cells, 3(4): 221-231, 2001; McCreath et al., Nature, 405(6790): 1066-1069, 2000). 한편, 이종 장기이식의 최적의 제공 원으로는 장기의 크기 및 생리적 특징이 인간과 유사하고 다산성에 의해 장기의 대량 공급이 가능한 미니 돼지가 고려된다. 돼지 장기의 성공적인 이식은 일련의 면역거부반응(초 급성, 급성 혈관성, 세포 매개성, 및 만성 면역거부반응)의 극복에 의존하다. 이식 후 수분 내에 발생하는 초 급성 면역거부반응은 알파-1,3-갈락토실 항원 결정기 합성에 관여하는 유전자를 제거하고 인체 보체 조절 유전자를 과다발현 시킴으로써 극복될 수 있음이 보고되었다. 구체적으로, 2002년 영국의 PPL사로부터 세계 최초로 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라아제(alpha-1,3-galactosyltransferase, 이하, ''GT''로 약창힘) 유전자가 이형접합적으로(heterozygous) 제거된 체세포 복제 돼지가 생산되었다 (Yifan Dai et al., Nat. Biotechnology, 20: 251-255, 2002). GT 유전자는 이종간 이식시 급속한 면역거부반응을 일으키는 원인 유전자로서, 이 유전자가 제거될 경우 생체거부반응이 제거된 이종간 장기 이식용 질환모델동물 개발이 가능하다. 2003년에 동 회사에서 GT 유전자가 동형접합적으로(homozygous) 제거된 체세포 복제에 성공함으로써 현 장기부족현상을 해결해 줄 수 있는 장기 이식용 질환모델동물 생산을 위한 획기적인 진보를 가져왔다(Carol J. Phelps, Science, 299: 411-414, 2003). 2005년 GT 유전자 제거된 복제 돼지 유래의 장기는 원숭이로 이식되었으며, 그 결과 급성 면역 거부반응 없이 이식 후 2-6 개월까지 생존이 지연됨을 보고하였다(Kenji Kuwaki et al., Nature Medicine, 11(1): 29-31, 2005). 그러나 GT 유전자가 제거되었음에도 불구하고 다른 경로를 통하는 이종 항원에 의해 인체 보체 유전자들이 활성화 됨으로써 장기 이식시 심각한 거부반응이 초래될 수 있음이 보고되었다(Tanemura, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 235: 359-364, 1997; Komoda, H. et al., Xenotransplantation, 11: 237-246, 2004). 그러한 장애를 극복하기 위해, GT 유전자 제거와 함께 분해 촉진 인자(decay-accerating factor, 이하, ''DAF''로 약칭함), 막 보조인자 단백질(membrane co-factor protein, 이하, ''MCP''로 약칭함), CD59와 같은 인체 보체 억제 유전자를 과발현하는 복제 돼지를 생산하는 방법이 사용되었다(Yoichi Takahagi, Molecular Reproduction and Development 71: 331-338, 2005 Cozzi, Eb et al., Transplant Proc., 26: 1402-1403, 1994; Fodor, W. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11153-11157, 1994; Adams, D. H. et al., Xenotransplantation, 8: 36-40, 2001). 한편, 인간을 제외한 대부분의 포유동물에 존재하는 N-글루콜릴뉴라미닌산(N-glycolylneuraminic acid, 이하, ''Neu5Gc''로 약칭함) 항원 결정기 또한 이종장기이식시 면역거부반응을 야기함이 보고되었다(WO20061133356A; Pam Tangvoranuntakul, Proc. Natl. Acad. Soc. USA 100: 12045-12050, 2003; Barbara Bighignoli, BMC genetics, 8: 27, 2007). Neu5Gc는 CMAH에 의해 N-아세틸뉴라미닌산(N-acetylneuraminic acid, 이하, ''Neu5Ac''로 약칭함)로부터 전환된다. 보체는 생체 내에서 면역작용에 관계하는 단백질들로 구성된 단백질 복합체 (C1-C9)로서 항원-항체 복합체가 형성되면 보체가 세균의 세포막에 결합하여 구멍을 내는 보체고정과 또는 항원-항체 복합체에 보체가 결합되어 식세포작용이 촉진되는 식균작용증진(opsonization)이 있다. 이러한 보체의 활동을 조절할 수 있는 여러가지의 조절 단백질들이 발견되었으며, 보체의 활성화를 막거나 활성화된 보체의 분해를 촉진함으로써 보체의 작용을 조절한다. 숙주의 세포막에 있는 DAF는 C2와 C4b의 결합을 방해할 수 있으며, MCP는 C4b의 분해를 촉진하여 보체가 숙주세포에서 활성화되는 것을 막아줌으로서 보체에 의한 숙주세포 파괴를 방지할 수 있다. 숙주 세포 표면에 있는 CD59는 C7, C8과 C5b6의 결합을 방해하여 막 공격 복합체의 형성을 막을 수 있다. 상기 보체 작용 조절 유전자 외에도, 인간 CD39 유전자의 과다발현에 의해, 이종장기이식 시 발생하는 혈전증이 억제됨이 보고되어져 있다(US20080003212A, Karren, M. D., The Journal of Clinical Investigation, 113: 1440-1446, 2004). 기존의 보고에 의하면, 외래 유전자의 정규장소 외의 발현은 배 발달에 장애를 야기하고 배아 발달 후기와 출생 후 초기에 대부분 발달하는 신경 시스템에 치명적이라는 문제점이 있다(Gao et al., Neurochem. Res., 24(9): 1181-1188, 1999). 이에, 상기 문제점의 극복을 위해, 예의 노력한 결과, 본 발명자들은 알파-1,3-갈락토실 항원 결정기 합성에 관여하는 GT 유전자 또는 Neu5Gc 항원 결정기 합성에 관여하는 CMAH 유전자를 제거함과 동시에 상기 유전자의 좌위에 이종 면역반응 또는 혈전증과 같은 이종장기 이식시 야기되는 부작용을 억제할 수 있는 인체 보체 조절 유전자 또는 혈전억제 유전자를 적중시켜, 상기 유전자를 과발현시킬 수 있는 타겟팅 벡터를 제작하였으며, 이를 이용하여, 상기 GT 유전자 또는 CMAH 유전자가 넉아웃되면서도, 당해 넉아웃된 위치에 삽입된 보체 조절유전자 또는 혈전억제 유전자가 과발현되는 체세포주의 제조에 성공하였다. 본 발명에 의해 제조된 타켓팅 벡터 및 형질전환 세포주는 면역거부반응에 관여하는 유전자들의 발현을 복합적으로 조절함으로써, 효율적으로 이종장기이식용 복제 돼지생산에 이용될 수 있다.