ＴＮＦα를 억제하는 안정적이고 가용성인 항체 document_id A220623062669

종양 괴사 인자 알파 (TNFα, 카켁틴이라고도 공지되어 있음)는 내독소 또는 다른 자극에 대한 반응으로 단핵구 및 대식세포 등을 비롯한 수많은 세포 유형에 의해 생성되는 천연 포유동물 사이토카인이다. TNFα는 염증성 반응, 면역학적 반응 및 병태생리적 반응의 주요 매개자이다 (문헌 [Grell, M., et al. (1995) Cell, 83:793-802]). 가용성 TNFα는 전구체 막횡단 단백질의 절단으로 형성되고 [Kriegler, et al. (1988) Cell 53:45-53], 분비된 17 kDa 폴리펩티드는 가용성 단독삼량체 복합체로 조립된다 (문헌 [Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262:6951-6954], TNF에 대한 검토는 문헌 [Butler, et al. (1986), Nature 320:584], [Old (1986), Science 230:630] 참조). 이들 복합체는 이후에 다양한 세포에 존재하는 수용체에 결합한다. 결합으로 인해 (i) 인터루킨 (IL)-6, IL-8 및 IL-1 등과 같은 다른 프로-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 방출, (ii) 매트릭스 메탈로프로테이나제의 방출, 및 (iii) 백혈구를 혈관외 조직으로 끌어들여서 염증 및 면역 캐스케이드를 더욱 증폭시키는, 내피 부착 분자 발현의 상향 조절 등을 비롯한 일련의 프로-염증성 효과가 발생된다. 많은 장애가 TNFα의 수준 상승과 관련이 있고, 이들 중 다수가 유의한 의학적 중요성을 갖는다. TNFα는 만성 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 염증성 장 장애, 예컨대 크론병 및 궤양성 대장염, 패혈증, 울혈성 심부전, 기관지 천식 및 다발성 경화증 등을 비롯한 수많은 인간 질환에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. 인간 TNFα에 트랜스제닉인 마우스는 TNFα를 높은 수준으로 구성적 생성하고, RA와 유사한 자발적이고 파괴적인 다발성관절염을 발병시킨다 [Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031]. 따라서, TNFα는 프로-염증성 사이토카인이라 불린다. 현재, TNFα는 열 및 권태 및 피로의 전신적 증상을 수반하는 다관절성 관절 염증 및 파괴를 특징으로 하는 만성, 진행성 및 허약화 질환인 RA의 발병에 있어서의 핵심 요인으로 수립되어 있다. RA는 또한 흔히 관절 연골 및 골 파괴로 진행되는 만성 활액 염증을 야기한다. RA를 앓고 있는 환자의 활액과 말초혈 둘다에서 TNFα의 수준이 증가한 것으로 밝혀졌다. TNFα 차단제가 RA를 앓고 있는 환자에게 투여되면, 이것들은 염증을 감소시키고 증상을 호전시키며 관절 손상을 지연시킨다 [McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208]. 생리적으로, TNFα는 또한 특정 감염으로부터의 보호와도 관련이 있다 [Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28]. TNFα는 그램(Gram)-음성 박테리아의 지다당류에 의해 활성화된 대식세포에 의해 방출된다. 이와 같이, TNFα는 박테리아 패혈증과 관련이 있는 내독소 쇼크의 발병 및 병리에 수반되는 매우 중요한 내인성 매개자라고 여겨진다 ([Michie, et al. (1989), Br. J. Surg. 76:670-671], [Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466], [Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5:27-47], [Waage et al. (1987). Lancet 1:355-357], [Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718], [Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497], [Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987], [Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170]). 다른 유기 시스템에 있어서도, TNFα는 중추 신경계, 특히 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군 및 중증 근무력증 등을 비롯한 상기 신경계의 염증성 장애 및 자가면역 장애, 및 알쯔하이머병, 파킨슨병 및 헌팅톤병을 비롯한 신경계의 퇴행성 장애에서도 핵심적인 역할을 하는 것을 밝혀진 바 있다. TNFα는 또한 시신경염, 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 피부근염, 근위축성 측삭 경화증 및 근육이영양증 등을 비롯한 망막 및 근육의 관련 시스템의 장애 뿐 아니라 또한 외상성 뇌 상해, 급성 척수 상해 및 졸중 등을 비롯한 신경계 상해에도 관련이 있다. 간염은, 다른 촉발인자 중에서도 엡스테인-바르 바이러스, 사이토메갈로 바이러스 및 A형 내지 E형 간염 바이러스 등을 비롯한 바이러스 감염에 의해 야기될 수 있는 또다른 TNFα-관련 염증성 장애이다. 간염은 문맥 및 소엽 영역에서 급성 간 염증을 일으키고, 이후에는 섬유증 및 종양 진행이 수반된다. TNFα는 암에서 대부분의 암 이환 및 사망을 야기하는 악액질을 매개할 수 있다 [Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305]. 염증, 세포의 면역 반응 및 많은 질환들의 병리상태에서 TNFα가 수행하는 핵심적인 역할로 인해, TNFα의 길항제가 조사되었다. TNFα는 그의 전신 차단이 임상적으로 발생된 감염, 특히 잠복 결핵의 재활성화의 빈도 및 중증도 증가 위험 및 가능하게는 림프종, 탈수초 질환 및 심부전의 유도 등을 비롯한 다른 위험을 수반하는 중요한 사이토카인이다. TNFα-매개 질환의 치료용으로 디자인된 TNFα 길항제의 한 부류는 TNFα에 특이적으로 결합하여 그의 기능을 차단하는 항체 또는 항체 단편이다. 항-TNFα 항체의 사용은 TNFα의 차단이 IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, 부착 분자 및 조직 파괴에서의 감소 등과 같이 TNFα로 인한 효과를 반전시킬 수 있음을 보여주었다 [Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350]. TNFα에 대한 항체는 내독소 쇼크의 예방 및 치료용으로 제안된 바 있다 [Beutler et al. (1985) Science:234, 470-474]. 패혈성 쇼크의 치료에 있어서 항-TNFα 항체의 용도는 문헌 ([Bodmer et al., 1993, Critical Care Medicine, 21:441-446, 1993], [Wherry et al., 1993, Critical Care Medicine, 21:436-440] 및 [Kirschenbaum et al., 1998, Critical Care Medicine, 26:1625-1626])에서 논의된다. 인간에서 항-TNFα 모노클로날 항체 또는 그의 TNFα 결합 단편의 투여에 의한 신경변성 질환의 치료 방법은 미국 제2003147891호에 개시된 바 있다. 제WO 0149321호는 신경 장애 및 TNFα에 의해 야기되는 관련 장애의 치료에 있어서 항-TNFα 항체를 비롯한 TNFα 차단제의 용도를 교시한다. 상기 문헌은 TNFα 길항제를 투여하여 상기 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 제WO 03047510호는 TNFα에 대한 여러 종류의 모노클로날 항체 및 조작된 항체, 이들의 제조 방법, 이들을 포함하는 화합물, 및 의약에서의 용도를 개시한다. TNFα 매개 질환 요법에 유용한 항체는 일반적으로 천연 공급원, 일반적으로는 마우스로부터 하이브리도마 기술로 생성된 모노클로날 항체 (mAB) 또는 조작된 항체이다. 조작된 항체는 전장 중쇄 및 경쇄를 포함한다는 점에서 천연 항체에 상응하거나, 또는 단백질분해성 절단에 의해 천연 항체로부터 생성될 수도 있는 Fab 단편에 상응하거나, 또는 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 단편이 펩티드 링커(linker)에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 scFv 항체에 상응한다. 항체의 중쇄와 경쇄는 둘다 불변 도메인 및 가변 도메인을 포함한다. 비-인간 항체는 면역원성이기 때문에, 소위 "하이브리드" 항체에서는 항체 중 인간-유사 서열의 양이 종종 증가되고, 이것은 인간 IgG의 불변 영역 및 동물 항체의 서열과 매치(match)되는 가변 영역을 포함하며, 대부분의 경우에는 원하는 특이성을 갖는 뮤린(murine) 항체이다. 이어서, 이들 가변 영역은 돌연변이유발에 의해 전형적인 인간 항체에 더욱 유사해지도록 추가로 조작되어 "인간화" 항체가 생성되도록 할 수 있다. 별법의 접근법에서, 마우스 항체 가변 영역의 항원 결합 부분, 즉 상보성 결정 영역 (CDR)만이 인간 항체의 프레임워크(framework)와 조합되어, "CDR-이식된" 항체가 생성된다. TNFα에 대한 모노클로날 항체는 선행 기술에 기재된 바 있다. 문헌 [Meager et al., 1087, Hybridoma 6:305-311]은 재조합 TNFα에 대한 뮤린 모노클로날 항체를 기재한다. 문헌 [Shimamoto et al., 1988, Immunology Letters 17:311-318]은 마우스에서의 내독소 쇼크 예방에 있어서 TNFα에 대한 뮤린 모노클로날 항체의 용도를 기재한다. 미국 제5,919,452호는 항-TNFα 키메라 항체 및 TNFα의 존재와 관련된 병리상태의 치료에 있어서의 그의 용도를 개시한다. RA 및 크론병 치료에 있어서 항-TNFα 항체의 용도는 문헌 ([Feldman et al. (1998), Transplantation Proceedings 30:4126-4127], [Adorini et al., 1997, Trends in Immunology Today 18:209-211] 및 [Feldmann et al., 1997, Advanced Immunology 64:283-350])에서 논의되고 있다. 이러한 치료법에 사용되는 TNFα에 대한 항체는 일반적으로 미국 제5,919,452호에 기재된 것과 같은 키메라 항체이다. 미국 제20003187231호는 결합 특성이 개선된 1개 이상의 비-인간 CDR 영역을 갖는 인간화 항-TNFα 항체를 개시한다. 추가로, 국제 특허 출원 제WO 92/11383호에는, TNFα에 특이적인 재조합 항체, 예컨대 CDR-이식된 항체가 개시되어 있다. 문헌 [Rankin et al. (1995), British J. Rheumatology 34:334-342]은 RA의 치료에 있어서 이러한 CDR-이식된 항체의 용도를 기재한다. 제WO 9211383호는 뮤린 모노클로날 항체 61E7, hTNFI, hTNF3 또는 101.4에서 유래된 TNFα-특이적 재조합 인간화 CDR-이식된 항체를 개시하고, 상기 항체의 제조 방법 및 TNFα-관련 장애의 진단 및/또는 요법에서의 용도를 교시한다. 오직 최근에만 시판되고 있는 TNFα의 특이적 억제제 중에서, TNFα에 대한 모노클로날 키메라 마우스-인간 항체 (인플릭시맙(infliximab), 레미케이드(Remicade)TM; 센토코르 코포레이션(Centocor Corporation)/존슨 앤드 존슨(Johnson ＆ Johnson))는 RA 치료에 있어서의 임상적 효능이 입증된 바 있다 ([Elliott et. al. 1994, Lancet 344:1105-1110], [Mani et al. (1998), Arthritis ＆ Rheumatism 41:1552-1563]). 인플릭시맙은 또한 염증성 장 장애 크론병 치료에 있어서의 임상적 효능 또한 입증된 바 있다 [Baert et al. 1999, Gastroenterology 116:22-28]. 미국 제22002037934호는 인플릭시맙과 같은 항-TNFα 항체의 투여에 의한 간염 치료를 개시한다. 미국 제6428787호는 인플릭시맙, CDP571 및 D2E7 등을 비롯한 항-TNFα 항체를 사용하여 신경 질환 및 TNFα-관련 질환을 치료하는 것에 대하여 교시한다. D2E7 (아달리무맙(Adalimumab))은 인간 항-TNFα 모노클로날 항체 (애보트(Abbott))로서, RA 및 크론병 치료를 위해 개발된 것이다 (제WO 9729131호). 셀테크(Celltech)는 크론병 치료용 인간화 모노클로날 항-TNFα IgG4 항체인 CDP571 (유럽 제0626389호) 및 RA 치료용 인간화 모노클로날 항-TNFα 항체 단편인 CDP870을 개발 중이다. 국소화 장애의 치료를 위해 상기 항체를 국소 투여하는 것은 미국 제2003185826호에 개시되어 있다. 많은 단일 쇄 항체 (scFv)는, 이들이 특히 예를 들어 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 등과 같은 기술을 이용하여 높은 결합능에 대하여 쉽게 선별될 수 있기 때문에 다수의 여러 항원에 대하여 생성되었다. 추가로, scFv 항체는 치료용 전장 항체의 제조와 비교할 때 비용이 덜 드는 미생물 시스템에서 제조될 수 있다. 통상적인 세포외 및 시험관내 용도 이외에도, scFv는 세포내 용도에도 성공적으로 이용되어 왔기 때문에 ([Woern et al. 2000, JBC, 28; 275 (4):2795-2803], [Auf der Maur et al. 2002, JBC, 22; 277 (47):45075-45085], [Stocks MR, 2004, Drug Discov Today. 15; 9 (22):960-966]), 세포내 항원에 대한 scFv가 개발되었다. 일반적으로, 기능적 scFv의 세포내 발현은 이들의 불안정성, 불용성 및 응집체 형성 경향으로 인한 한계가 있다. 이러한 이유로, 세포내 환경 (예를 들어 핵, 세포질)에 전형적인 환원 조건하에서 특히 가용성이고 안정적인 scFv 항체에 대한 생체내 스크리닝 시스템이 소위 "품질 제어(Quality Control)" 스크리닝을 이용하여 성공적으로 개발되었고 (제WO 0148017호, [Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412], [Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224]), 이러한 목적을 위한 특히 안정적이고 가용성인 scFv 프레임워크 서열이 동정되었다 (제WO 03097697호). 추가로, 이들 프레임워크는 세포외 환경의 천연 산화 조건하에서도 우수한 발현 수준 및 증대된 안정성 및 가용성을 나타낸다. 따라서, 이러한 유리한 생체물리학적, 생화학적 성질로 인해 유리한 높은 생산 수율이 가능하고, 일단 특이적 항원에 대해 지시된 이들 항체 단편이 단백질 치료제로서, 특히 치료 영역에 국소 및/또는 전신 적용될 수 있게 한다. scFv 항체와 Fab 단편 모두에는 전장 항체와는 달리 단핵구, 예를 들어 천연 킬러 세포의 Fc-수용체에 의해 인식되는 Fc 부분이 결여되어 있기 때문에, 이것들은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 일으키지 않으며, 따라서 비-표적 세포상의 Fc-수용체와의 결합으로 인한 비특이적 독성을 야기하지 않는다. 따라서, RA 등과 같은 TNFα-관련 장애의 치료, 특히 국소 투여에 의해 부작용 정도가 낮은 지속적이고 제어된 요법을 제공할 수 있는 치료에 효과적인 새로운 형태의 항체가 요구된다. 본 발명은 관절염 및 다른 TNFα-매개 장애 또는 병태생리적 메카니즘, 특히 다양한 형태의 통증의 염증 과정의 효과적이고 지속적인 치료를 위한 항체, 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 인용된 모든 간행물 및 참고자료는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 발명의 개시 따라서, 본 발명의 일반적인 목적은 TNFα에 시험관내 및 생체내 특이적으로 결합하는 안정적이고 가용성인 항체 또는 항체 유도체를 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 유도체는 scFv 항체 또는 Fab 단편이다. 이제, 본 발명의 이러한 목적 및 추가의 목적은 하기하는 기재로부터 보다 더 명백해질 것이며, 상기 항체 또는 항체 유도체는 서열 2의 서열로 이루어지거나 서열 2의 서열에서 유래된 중쇄 가변 도메인과 조합된, 서열 1의 서열로 이루어지거나 서열 1의 서열에서 유래된 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 유래된 서열일 경우에는 상기 서열이 상기 VL 도메인의 프레임워크 내에는 최대 5개 이하의 변화 및/또는 상기 VH 도메인의 프레임워크 내에는 최대 9개 이하의 변화를 갖는다는 특징이 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 프레임워크 내의 임의의 위치, 바람직하게는 VL 도메인의 위치 4, 46, 65, 67 70 및 83의 군에서 선택된 하나 이상의 위치 및/또는 VH 도메인의 위치 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 및 112의 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 1개 이상의 아미노산 변화가 도입된 상기 항체 또는 항체 유도체이다. 더욱 바람직하게는, 1개 이상의 상기 전환이 VL의 경우에는 서열 3 및/또는 VH의 경우에는 서열 4에 존재하는 아미노산이 되도록 하고, 훨씬 더욱 바람직하게는 총 13개 이하의 전환이 존재한다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 유도체는 서열 1의 서열의 VL 도메인 및/또는 서열 2의 서열로 이루어지거나 서열 2의 서열에서 유래된 VH 도메인, 또는 서열 11의 서열의 VL 도메인 및 서열 4의 서열의 VH 도메인을 포함한다. 본 발명의 항체의 VH 도메인이 서열 1의 VL 도메인을 포함하는 경우, 바람직한 실시양태에서는 VH 서열이 서열 2에서 유래되고, 위치 68의 페닐알라닌이 알라닌, 루이신, 이소루이신 또는 발린으로 변화된다. VH 내의 추가 변화는 임의적이다. 이러한 종류의 scFv 항체는 서열 31, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36 및 서열 37에 기재되어 있다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 항체 유도체는 서열 1의 VL 서열 및 서열 2의 VH 서열을 갖고 1개 이상의 CDR에 서열 5의 VL 서열 및/또는 서열 6 또는 서열 25의 VH 서열의 상응하는 CDR에 존재하는 잔기로 전환된 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 항체에서 유래된다. 본 발명의 훨씬 바람직한 실시양태에서는, 상기 항체 또는 항체 유도체에서 VL CDR2, VL CDR3, VH CDR2 또는 VH CDR3의 군 중 1개 이상의 CDR이 서열 5의 VL 서열 및/또는 서열 25 또는 서열 6의 VH 서열의 상응하는 CDR로 전환된다. 가장 바람직하게는, 상기 항체 또는 항체 유도체는 하기하는 VL/VH 서열 조합을 포함한다: VL 서열 7/VH 서열 2, VL 서열 8/VH 서열 2, VL 서열 1/VH 서열 9, VL 서열 1/VH 서열 25, VL 서열 1/VH 서열 28, VL 서열 1/VH 서열 29, VL 서열 26/VH 서열 30, VL 서열 27/VH 서열 30. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 인간 TNFα에 대한 특이성을 갖는다. 바람직하게는, 항원 결합은 Kd가 약 100 nM 이하임을 특징으로 한다. 더욱 바람직한 것은 Kd가 10 nM 이하인 항체이고, 가장 바람직한 것은 Kd가 1 nM 이하인 항체이다. 본 발명에 따른 항체 유도체는 예를 들어 Fc 융합체, 독소 융합체, 효소 활성 융합체, 여러가지 포맷, 예를 들어 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일 쇄 항체, 이중특이적 항체 단편, 특히 scFv 및 Fab 단편 등이다. 본 발명의 또다른 바람직한 목적은 VL 도메인 및 VH 도메인이 링커에 의해, 바람직하게는 VL-링커-VH 서열 배열로 연결된 scFv 항체이다. 더욱 바람직하게는 상기 링커가 서열 10의 서열을 갖는다. 본 발명의 또다른 바람직한 목적은 서열 40에서 유래된 scFv 항체 (TB-A)이다. 이러한 항체는 돌연변이유발로 수득될 수 있고, 프레임워크, CDR 및/또는 링커 서열에서 3개 이하의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, scFv 항체는 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37 또는 서열 38의 서열을 갖는다. 본 발명의 또다른 바람직한 목적은 인간 Ig 카파 쇄의 불변 영역에 융합된 VL 도메인, 및 인간 IgG의 CH1 도메인에 융합된 VH 도메인을 포함하고, 상기 2개의 융합 폴리펩티드가 쇄간 디술피드 연결기(bridge)에 의해 연결된 Fab 단편이다. 또다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체, 예를 들어 항체 단편은 표지되거나 화학적으로 변형된다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 유도체를 코딩하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열을 함유하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 추가로, 상기 DNA 서열로 형질전환된 적합한 숙주 세포가 제공되며, 이것은 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 포유동물 세포일 것이 선호된다. 추가로, 본 발명의 임의의 항체 또는 항체 유도체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포를 상기 항체 또는 항체 유도체의 합성을 허용하는 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 분자를 상기 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 생산 방법이 제공된다. 바람직하게는, 상기 방법은 이. 콜라이에서 정제된 scFv 항체 또는 Fab 단편을 제공한다. 본 발명의 또다른 측면은 시험관내 진단용 진단 도구 및/또는 의약품으로서 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항체 유도체의 용도이다. 이러한 용도는 임의의 TNFα 관련 상태와 관련하여 특히 바람직하다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체 유도체, 및 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, TNFα-관련 질환의 치료용 의약으로서 사용되는 조성물을 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 유도체를, 바람직하게는 TNFα에 특이적인 항체 또는 항체 유도체가 아닌 제2 화합물과 함께 포함하는 조합 제제를 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 scFv 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터가 유전자 요법에 사용된다. TNFα-관련 질환의 치료는 TNFα와 상기 항체 또는 항체 유도체와의 강력한 상호작용으로 인한 TNFα의 차단에 의해 달성된다. 바람직하게는, 자가면역, 급성 또는 만성 염증 상태, 암-관련 질환, 통증, 신경 및 신경변성 장애, 감염성 질환 및 심혈관 질환의 치료가 예측된다.