연장된 효과를 가지는 진통제로서 ＮＧＦ와 ＴｒｋＡ리셉터 사이의 결합을 억제할 수 있는 분자 document_id A220623062687

연수에 구심성인 침해수용성 신호는, 이들(1차 감각 뉴런)의 세포체가 척수 후근 신경절(DRG)에 위치한, Aδ 및 C 섬유들에 의해 전달된다. 1차 감각 뉴론은 흥분 전달물질로서 ATP와 함께 글루타메이트와 P와 CGRP(Calcitonin-gene-related-peptide)와 같은 다양한 다른 물질들을 방출한다(Hunt and Mantyh, 2001). 이러한 흥분전달 물질의 방출은 캅사이신(vanilloid receptor, VR1)에 민감한 것, GABA에 의해 활성화되는 것, ATP 자체에 의해 활성화되는 것 및 칸나비노이드(CB1)에 의해 활성화되는 것을 포함하여 구심 신경 말단에 존재하는 리셉터의 여러 계열에 의해 조절된다(Sivilotti and Nistri, 1991; Hunt and Mantyh, 2001; Khakh, 2001; Morisset et al., 2001). 만성 통증이 발생하는 병태생리학적 기작의 하나가 이질 통(allodynia), 즉, 일반적으로 아프지 않은 자극의 통각으로의 변형을 말한다. 이 현상은 캅사이신 리셉터인 VR1 및 ATP에 대한 이오노트롭 리셉터를 포함하는, 다양한 이온 흐름과 이로 인한 "리간드-게이트(ligand-gated)" 타입의 다양한 채널을 포함한다(Khakh, 2001). 척수의 침해수용성 개재뉴런에서 ATP에 대한 리셉터와 VR1에 대한 리셉터의 동시 활성은 통증적 자극의 전달을 보강하는 것으로 흥분성 시냅스 신호의 상당한 축적을 야기했다(Nakatsuka et al., 2002). 그러므로 이것을 기반으로, ATP 리셉터(특히 P2X3 계통에 속하는 리셉터들)가 통증 경로에서 기본적인 역할을 수행하는 것이 명확하다(Burnstock, 2001). 이러한 리셉터는 통증유발성 자극에 의해 활성화되는 말초신경 말단, DRGs의 뉴론 세포체 및 이의 시냅스 앞부분 말단, 및 천연적으로 연수의 시냅스 후부의 말단에 존재한다(Khakh, 2001). 신경성장인자(NGF)와 이의 고친화 리셉터, TrkA(Levi-Montalcini, 1987; Levi-Montalcini et al., 1996; Frade and Barde, 1998;, 1998)에 의해 구성된 시스템이 "지속적인" 통증의 주요 양상을 기본으로 하는 분자 과정에서 기초적인 역할을 수행한다는 것을 보여주는 상당한 증거가 있다. 이것은 NGF/TrkA 시스템을 막는 항체에 대한 주요 치료 부분(특히 "tonic" 형태라는 통증의 하나)을 가리킨다(Levine, 1998). 신경 침해수용성 뉴런의 발달은 NGF에 많이 의존하고, 성인 침해수용성의 반응들이 같은 인자에 의해 조절된다(Julius and Vasbaum, 2001). 특히, NGF는 캅사이신 통증유발성 자극의 급성 감작을 일으킨다(Shu and Mendell, 1999). 기능적 관점에서 부터, 만성 염증에 이어, 침해수용성 뉴론은 그들의 활성 전위의 빈도 및 지속시간의 변화를 진행시킨다. 만성통증 상태의 전형인 과흥분의 상당한 감소를 이끄는 내인성 NGF를 막아 이러한 현상을 억제한다(Djouhri et al., 2001). 성인 침해수용기에서 통증 역치를 정의하는데 있어 NGF 활성은 TrkA 리셉터에 의해, 또한 침해수용성 말단에 존재하는 VR1 리셉터에 의해 매개되는 반응의 조절을 통해 매개된다. VR1 반응의 TrkA 의존성 상승작용은 포스포리파제 C의 감마 모델의 세포내 형질도입(transduction)통로를 통해 나타나는 것으로 생각된다(PLCgamma, Chuang et al., 2001). 말초 NGF의 수준은 염증과정에서 증가하는 반면, 외인성 NGF의 투여는 랫트에서는 통각과민효과를 가지고 인간에게는 근육통을 야기한다. 더욱이, NGF는 일반적으로 인간 및 포유동물에서 열 자극에 대한 과민성을 야기했다. NGF는 거대세포, 섬유아세포, 및 염증과정이 일어나는 말초부분의 다른 세포 타입에 의해 방출된다. 특히 거대세포는 기본적인 역할을 수행하는 것 같다(Woolf et al.,1996). 이러한 세포가 NGF를 생산하고 동시에 그들 세포 표면에서 기능성 TrkA 리셉터를 발현하므로(Nilsson et al., 1997), 이들은 라이소포스파티딜세린의 존재하에 NGF 그 자체에 반응할 수 있다(Horigome et al., 1993; Kawamoto et al., 2002). 그 결과 NGF/TrkA 시스템은 통증유발 염증 신호의 국부적 증폭을 허용하는 양성피드백 오토크린(autocrine) 기작을 통하여 거대세포 활성을 매개하는 것 같다. 높은 수준의 NGF는 또한 뉴론에서도 발견되는데, 이 neurotropin은 통증에 연관된 신경섬유의 변형에 확실히 책임이 있다(Harpf et al., 2002). 어떤 형태의 암에서, 과도한 NGF는 종양성 통증을 야기하는 신경섬유의 성장 및 침윤을 촉진한다(Zhu et al., 1999). 최근 실험적 연구에서 NGF를 막는 것에 의해, 손상된 뉴론의 세포체를 손상하지 않고, 신경병증성 통증에 책임이 있는 신경종의 형성을 상당히 줄일 수 있음을 보여주었다(Kryger et al., 2001). 이러한 결과는 만성 통증의 치료를 위한 NGF의 효과의 감소를 기반으로 한 치료 접근 방법에 중요한 관심을 이끌어 내었다(Saragovi and Gehring, 2000). 최근, 통증 도입의 분자적 과정에서 NGF/TrkA 시스템의 수반은 유전적인 토대에서 또한 증명되어 왔다. 특히, (염색체 1q21-q22에 위치하는)TrkA 유전자의 돌연변이는 CIPA("congenital insensitivity to pain with anhydrosia")로 알려진 유전성 열성 상염색체 증후군을 담당한다. CIPA는 재관류성 일시적인 열, 발한장애, 통증 유발 자극 반응 결손, 정신 지체와 자해의 경향을 갖는 것이 특징이다(Indo et al., 1996; Saragovi and Gehring, 2000; Indo, 2001; Indo et al., 2001). 침해수용성 반응에서 NGF의 수반이 추가적으로 확인된 것은 최근 항-NGF 유전자 도입 랫트(AD11)의 표현형 특성에 대한 작업으로 얻어졌다. 이러한 동물에서 항-NGF 항체 αD11의 이소성 발현은 성인에서 NGF의 기능적 차단을 발생시킨다. 이 차단은 일관된 방식에서 해로운 열 자극에 대한 반응의 잠복기 증가로 해석된다(Capsoni et al., 2000; Ruberti et al., 2000). 리간드나 리셉터를 막음으로써 NGF/TrkA 시스템의 생물학적 활성을 중화할 수 있는 항체들은 통증 치료에서, 특히 지속적 형태의 통증에서 중요한 요인으로 나타날 수 있다. 이러한 상황에서 가장 최근의 발표물은 항-NGF 항체를 중화하는 것으로 치료하는 것이 쥣과 동물의 종양학적 통증 모델에서 상당한 통증의 감소를 야기한다는 것을 나타낸다(Sevcik et al., 2005). 그럼에도 불구하고, Sevcik et al에 의하여 사용된 투여 프로토콜에서 항-NGF의 마지막 주입과 행동 관찰 사이의 최대 지연시간은 4일을 초과하지 않아, 이것은 장기적인 효과가 없다. 장기적인 효과는 항체의 마지막 투여 후, 최소 1~2주 동안 지속적으로 확인되는 효과로서 항체 그 자체의 효과 및 혈류농도 간 상호작용이 필요 없음을 의미하는 것으로 정의될 수 있다. 장기적인 효과는 새로운 유전자 발현을 요구할 수 있고 원래의 병태생리학적 상태의 반영구적이거나 연장된 변형을 나타낼 수 있다. 많은 사례에서, 장기간의 효과를 낼 수 있는 약제는 "질병-변형적" 활성 원리로 정의될 수 있는데, 다시 말해 증상에 대해 단순한 약물학적 효과를 나타내는 제품과는 다르게, 병의 경과를 철저하게 개조할 수 있다는 것이다. 본 발명자들은 TrkA 리간드에 의해 매개되는 NGF의 생리적 효과를 막을 수 있는 (NGF 리간드에 대한)항체의 패널을 처리했다. 두 개의 시약:αD11(항-NGF) 및 MNAC13 (항-TrkA)이 특히 흥미롭다. 하나는 리간드에 대한 항체와 리셉터에 대한 나머지 항체인 이 두 항체 간의 비교는, NGF 리간드의 저해제가 TrkA 리셉터의 억제에 기능적으로 동등하지 않기 때문에 상당히 중요하다. 사실상 세 가지 점을 고려해야 한다: i) 같은 시스템의 맥락에서, 화학량적 근거인 리간드 및 리셉터의 유용성은 시간에 따라, 다른 식으로 다양하고, 상당히 다를 수 있다. ii) 모든 신경성장인자에 의해 나누어지고, TrkA에 대한 명확한 생리적 기능을 매개하는 NGF (p75)에 대한 두번째 리셉터 존재(Hempstead, 2002); iii) 생리활성의 면에서 독특한 성질과 바람직하게 p75 리셉터에 결합되는 것으로 특성화되는 천연적으로 NGF (pre-pro-NGF)의 "미성숙" 형태로의 존재(Lee et al., 2001). αD11은 마우스 NGF에 대한 랫트 단일클론의 항체이다(그러나 랫트 및 인간의 NGF도 인식할 수 있음). NGF와 이것의 상호작용은 생리적 활성을 막아 TrkA와의 결합을 억제할 수 있다(Cattaneo et al., 1988). αD11 역시 p75 리셉터로의 NGF의 결합을 억제한다. 이 항-NGF 항체는 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 둘 다에서 보여진, 항원(picomolar)과의 결합에 대한 친화성 및 중성화 특성을 통해 (모든 신경성장 인자와 비교하여)이 항원과의 결합의 특이성 면에서 절대적으로 독특하다(Cattaneo et al., 1988; Berardi et al., 1994; Molnar et al., 1997; Molnar et al., 1998). 알파D11 에피토프는 분자의 바깥 부분에 노출되어 있고, 공간적으로 서로 매우 근접한 NGF 루프 I 및/또는 NGF 루프 II의 레벨에 있다. 더욱이 다른 종에서 알파D11의 보존된 반응성은 이러한 두 개의 루프의 아미노산 잔기가 많이 보존되어 있기 때문에 에피토프 할당과 일치한다. 알파D11의 강력한 중화 활성은 인지된 에피토프가 NGF 리셉터 결합 부위에 매우 근접함을 나타낸다. 더욱이 신경성장인자 군의 다른 구성원의 알파D11의 교차 반응성의 부족은 다음을 제시한다: i) 에피토프는 다른 신경성장인자와 공유하지 않는 NGF 영역에 위치한다, ii) 에피토그 그 자체는 NGF-TrkA 인지를 매개하는 "특성화 경로(specificity path)"에 포함될 수 있다. NGF 분자상에서 알파D11 항체에 의해 인지된 에피토프는 NGF 돌연변이체의 광범위한 패널에 대한 항체의 결합 활성을 테스트하여 확인하였다. 이 조직적인 선별을 기본으로, NGF 분자의 영역(aa.41-49, 루프 I)은 NGF 분자의 꼭대기에서 높게 발현되고 항원에 대한 항체의 결합의 (비록 배타적이지는 않지만)원인이 되는 것으로 확인이 되었다(Gonfloni, 1995). 사실상 NGF aa.영역 23-35(루프II) 역시 이 결합에 기여할 수 있다. MNAC13 항체는 인간 TrkA 리셉터에 대한 마우스 단일클론성 항체로(Cattaneo et al., 1999; Pesavento et al., 2000), 즉, 인 비트로와 인 비보 모두에서 NGF에 의한 TrkA 활성화 과정의 억제와 하류의 생리적 기능의 억제에서 특히 효과적이다(Cattaneo et al., 1999; Pesavento et al., 2000). 항체는 구조 면에서(Covaceuszach et al., 2001), 그리고 TrkA 리셉터와의 분자적 상호작용에서 상세히 특성화되었다(Covaceuszach et al., 2005). 이러한 구조에 관한 깊이있는 지식을 기반으로 혁신적인 방법에 의하여, 모체 변형물과 같은 항원 결합 특성을 나타내는 αD11 및 MNAC13의 인간화 변형물(Hu-αD11 및 Hu-MNAC13)이 만들어졌다(특허 출원 WO 05/061540). 신경병성 기원(1차 병변 혹은 신경계의 기능장애에 기인함, 예를 들어, 연수의 병변에 의한 통증)의 통증을 치료하고, 종양적 통증을 치료하고, 그리고 (역시 염증성 특징의) 지속적인 통증의 수많은 다른 형태에 대해 현재 유용한 치료법은 제한적인 효과가 있음을 발견하였다. 그러므로 부작용과 관련된 문제를 해결하기 위해 진통제 활성을 가지고 있으면서, 현재 사용되는 진통제와 비교하여 다른 기작을 통해 작용하는 새로운 분자를 확인하고 개발할 명백한 필요성이 있다. 국제 특허 출원 WO 02/20479는 강력한 진통제 활성을 가지는, TrkA 리셉터를 억제하는 작은 합성 분자를 개시한다. 그럼에도 불구하고, 특정 통증 모델에서 이러한 분자의 효과가 증명되지 않았다. 더욱이 항체와 비교하여 작은 분자는 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 해마토엔세팔릭(haematoencephalic) 막에 쉽게 침투하는 결점이 있다. 사실 알츠하이머를 포함한(Saper et al., 1985) 진행성 신경퇴화의 다양한 형태에 의해 영향을 받는 신경성 개체인 전뇌기저부의 콜린성 뉴론은 TrkA 리셉터를 발현하고 정확한 기능을 위해 NGF에 의존한다(Holtzman et al., 1992). 국제 특허출원 WO 01/78698은 신경병성 혹은 종양성 통증을 제외한, 만성 복통을 치료하거나 예방하기 위한 NGF 길항제의 사용을 제안하였다. 비록 상기 출원은 길항제가 NGF와 TrkA 리셉터 둘 다에 결합할 수 있다고 기재하고 있지만, 이것은 길항제가 TrkA 리셉터에 결합할 때, 이 리셉터가 기능적으로 차단된다는 것을 증명하는 것은 아니다. NGF/TrkA의 생리적 활성을 막는 두 개의 항체 MNAC13과 αD11의 능력을 기반으로 하여, 두 개의 항체 MNAC13 및 αD11 그리고 이들 각각의 인간화 변형물은 지속적인 통증의 다양한(설치류) 동물 모델, 특히 신경병적 특성의 만성 통증의 평가에 유용한 모델 중 하나인 모델 CCI("만성 협색 장애(Chronic Constriction Injury)", 좌골 신경의 만성 협색증)에서 실험되었다(Bennett and Xie, 1988).