작은 양을 전류로 처리하는 방법 document_id A220623062722

예컨대 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 생리활성 분자(biologically active molecules)를 살아있는 세포에 주입하는 것은 이들 분자의 생물학적 기능 분석에 중요한 도구이다. 이질의 분자를 세포에 주입하는 바람직한 방법으로는 전기천공(electroporation) 방법이 있으며, 이 방법은, 화학적 방법과는 대조적으로, 다른 생리활성 분자의 동시 운송에 의존하지 않는다. 전기천공 방법에서, 이질의 분자는 간단한 전류 흐름을 통해 세포배양기로부터나 세포에 적응된 완충용액으로 부터 세포 내로 주입된다. 세포막은 짧은 전기 펄스 작용에 의해 이 이질의 분자에 침투성이 있게 된다. 게다가, 세포부유물은 소위 큐벡(cuvette), 즉 상부가 개방되어 있고, 그 내부는 평행하고 서로 마주보게 배치된 두 개의 측벽 쌍으로 형성된 좁은용기(vessel)에 놓인다. 이 용기의 내부는 세포 부유물, 즉, 일반적으로 수성 완충용액이나 세포 배양기를 받아들일 수 있으며, 이러한 완충용액이나 세포 배양기에서, 처리될 세포가 부유 상태에 놓인다. 그러한 큐벳은 일반적으로 한 쌍의 마주보는 측벽의 하단부에 한 쌍의 전극을 가지며, 이로 인해 전압이 인가된다. 이들 전극에서 전기 방전으로 인해, 전류가 전극 사이에 흐르게 되며, 세포 부유물을 거쳐서, 핵산이나 다른 분자가 세포 내로 운송되게 되거나, 선택된 조건에 따라서, 세포 융합을 초래한다. 강한 전계, 즉 높은 전류 밀도의 짧은 펄스를 간단히 인가한 결과, 세포, 세포 파생물(cell derivatives), 부세포 분자(sub-cellular particles) 및/또는 소포(vesicles)가 또한 융합될 수 있다. 이러한 소위 전기융합 방법에서, 세포는 먼저 예컨대 비균질 교류계를 통해 가까운 막에 접촉된다. 전계 펄스를 순차적으로 인가하면, 막의 일부분이 상호작용하게 되어, 결국 융합하게 된다. 이러한 전기 융합 방법의 경우, 전기천공 방법에 사용된 장치와 비교될 만한 장치가 사용될 수 있다. 전기천공 방법 동안에, 생리활성 분자는 먼저 세포막에 잠시 생성된 '천공'을 통해 세포질 내로 들어간다. 특정한 경우, 이 분자는 이미 세포질 내에서 해당 기능을 수행할 수 있고, 후속해서, 특정한 조건에서, 핵에도 들어갈 수 있다. 특히, 생리활성 분자가 단지 핵에서 해당 기능을 수행할 수 있는 응용의 경우, 예컨대 유전자의 단백질합성과정이 분석되고, 특히 분할 없이 또는 아주 낮은 분할율을 갖는 세포, 예컨대 1차 세포가 사용되는 경우, 생리활성 분자가 핵 내로 직접 운송되는 것이 유리하다. 그 전체 내용이 참조사항으로 본 명세서에 병합된 미국특허출원(US2004014220)에 개시된 전기천공 방법으로부터, 그러한 경우, 높은 트랜스펙션(transfection) 효율을 얻기 위해, 적어도 2kV/cm의 전계 세기를 갖는 강한 전계가 높은 전압 펄스를 통해 적어도 10㎲의 미리 설정된 기간 동안 완충용액에서 생성되어야 한다는 점을 알 수 있다. 미생물을 높은 전류에 의해 처리하는 방법은 또한 미국특허출원(US2005064596)으로부터 알려져 있으며, 이 출원의 전체 내용이 참조사항으로 본 명세서에 병합되어 있다. 여기에 개시된 방법에서, 미생물은, 높은 트랜스펙션 효율을 얻는 동안 낮은 세포 사망률을 보장하기 위해 적어도 200mmol/l의 이온 세기인 완충용액에 담겨진다. 특히 HT(High Throughput) 분석에서, 복수의 반응 회분(reaction batch)이 동시에 가능한 가장 짧은 시간에 테스트되어야 하는, 주로 생화학 및 의약 응용에서, 가능한 많은 수, 예컨대 96개나 384개의 반응실을 제공해야 한다. 이러한 환경에서 사용된 반응 용기는 일반적으로 멀티 웰 플레이트(multi well plate), 미량 적정 플레이트 또는 멀티 웰(multi well)로 지칭된다. 이들 용기의 개별 반응실('웰')은 상대적으로 작으며, 따라서 작은 부피만을 수용할 수 있다. 게다가, 완충용액 및 세포 물질을 절약하기 위해 더 작은 샘플 부피를 사용하는 것이 종종 유리하다. 게다가, 특히 예컨대 1차 세포와 같은 귀중한 세포 물질의 경우, 단지 소량의 세포만이 일반적으로 이용 가능하다. 그러므로, 작은 샘플 부피로 연구하는 것이 종종 바람직하고 특정한 경우 필요하다. 전기 가수분해 방법(electrical hydrolysis)은 액체에 강한 전계를 생성시킬 경우 발생하는 부작용으로 인해서 배제될 필요가 없다. 가장 적은 경우에도, 전극의 표면에 기포 생성을 통해 전기분해를 목격할 수 있으며, 이러한 기포 생성은 다시 거품을 생성시킨다. 극단적인 경우, 폭발할 듯이 많은 기체가 생성되며, 이것은 최종적인 변위 효과로 인해, 전극 사이의 영역으로부터 샘플들을 배출한다(이후 '스패터링(spattering)'이라 함). 이렇게 배출되면, 일반적으로 샘플(들)이 손실되거나, 적어도 샘플은 예상 시간 동안 전계에 남아 있지 않게 된다. 그러므로 샘플의 이러한 스패터링은 정성적으로(qualitatively) 및/또는 정량적으로(quantitatively) 테스트 또는 샘플 처리의 결과를 손상시키며, 게다가 결과의 재현에 부정적인 영향을 미친다. 그에 따라, 생물학적 세포를 전계에서 처리해야 하는 여러 응용에서, 특히 전기천공 방법 동안에, 전기분해는 바람직하지 않은 부작용을 일으킨다. 이론상, 스패터링 확률은 전기 전도도를 줄임으로서 감소할 수 있다. 그러나 단단한 세포벽이 제공되지 않은 더 고차원의 세포는 일반적으로 특정한 오스몰농도의 용액에서만 생존할 수 있다. 일반적으로 전해질은 또한 특히 오스몰 농도 면에서 효율적으로 용해된 물질이며, 결국 다소 높은 전기 전도도의 용액을 얻는다. 예컨대 전기천공 방법을 실행하기 위해, 이온을 세포 부유물 내로 주입하는 것이 일반적으로 필요하며, (그 전체 내용이 참고사항으로서 본 명세서에 병합된) 미국특허출원(US2005064596)에 개시된 바와 같이, 또한 유리하다. 따라서 실제 전기 전도도를 줄임으로써 스패터링 가능성을 감소시키는 데는 한계가 있다. 따라서, 그러한 경우, 가변 전기분해를 예상할 수 있다. 따라서 스패터링의 발생은 확률적 사건이다. 이것이 의미하는 점은, 이러한 사건이 단지 확률로 기재될 수 있다는 것이다. 규정된 조건에 따라, 바람직하지 않은 스패터링의 빈도는 예컨대 5% 이하일 수 있거나, 또한 95%이상일 수 있다. 따라서 스패터링의 확률은, 특히 낮은 부피가 높은 전류 밀도에서 사용될 경우에 높다. 프로세스를 생산단계로까지 발전시키기 위해서, 이러한 문제는 고객에 의해 사용될 수 있는 적절한 방법에 의해 이러한 확률을 예컨대 1% 이하까지 줄이는데 걸림돌이 되었다. 따라서 본 발명에 의해 해결해야 할 문제는 전극 사이의 영역으로부터 샘플의 원치 않는 배출의 빈도를 상당히 줄이는, 앞서 언급한 유형의 방법을 제공하는 것이다.