ｓｃ（Ｆｖ）２를 함유하는 의약조성물 document_id A220623062748

sc(Fv)2는 2개의 경쇄 가변영역(VL)과 2개의 중쇄 가변영역(VH)의 4개의 가변영역을 링커 등으로 결합하여 단일 사슬로 한 항체이다(Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). 예를 들면, VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4나 VL2-linker-VH1-linker-VL4-linker-VH3 서열을 갖는 단일 사슬 항체가 알려져 있다. sc(Fv)2의 구조는 Fv(VH, VL 사이에서 비공유결합한 분자)의 조합에 의해 VH1과 VL2, VH3와 VL4가 각각 Fv를 형성하는 sc(Fv)2와, VH1과 VL4, VH3와 VL2가 각각 Fv를 형성하는 sc(Fv)2의 2종류의 구조 이성체가 존재하는 것으로 생각된다. 그러나, 지금까지 sc(Fv)2의 연구는 이중특이성(Bispecific) sc(Fv)2에 관한 것이 많았기 때문에, sc(Fv)2의 구조 이성체에 대해서는 거의 보고가 없다. 이중특이성 sc(Fv)2는 VH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4의 서열에 있어서, VH1과 VL4 및 VH3와 VL2(또는 VH1과 VL2 및 VH3와 VL4)가 상이한 단일클론항체 유래의 가변영역을 갖는 sc(Fv)2이다. 이중특이성 sc(Fv)2의 경우에는 VH1과 VL4 또는 VH3와 VL2(또는 VH1과 VL2 또는 VH3와 VL4)가 동일한 단일클론항체 유래인 측면에서 Fv를 형성하는 효율이 높아지고, 구조 이성체의 출현은 어느 정도 억제될 것으로 생각된다. 실제로, 링커 길이를 15-5-15와 15-15-15의 이중특이성 sc(Fv)2를 제작해도 활성은 변하지 않는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5). 따라서, 이중특이성 sc(Fv)2의 경우는 구조 이성체에 관해서는 상세한 언급이 되어 있지 않은 경우가 많다. 예를 들면, 비특허문헌 3, 4, 8, 9는 이중특이적 결합활성을 확인함으로써 바른 조합의 Fv가 존재하는 것은 나타내고 있지만, 바르지 않은 Fv의 조합의 존재비율이나 양자의 존재비의 정량적인 평가에 관한 기재는 없다. 또한, 비특허문헌 6은 이중특이성 sc(Fv)2의 링커 길이를 변화시키는 것(양단 또는 중앙의 링커 길이의 개변)에 의해, 모노머(monomer), 다이머(dimer)의 구조변환을 확인하고 있지만, sc(Fv)2의 구조 이성체에 대해서는 분자구조 모델 예측으로의 논의에 머물고 있어, 실제 시료에 있어서의 구조 이성체의 존재비율이나 구조의 동정(同定)에 관한 기재는 없다. 또한, sc(Fv)2의 구조 이성체에 대해서 착안하고 있지 않았기 때문에, 구조 이성체의 제어에 대해서도 상세한 검토는 되어 있지 않다. 비특허문헌 10에 있어서도 링커 길이를 5-15-5 또는 15-5-15로 함으로써, 각각 단일 사슬 디아바디(single chain diabody) 또는 2가(bivalent) scFv의 구조를 취하는 것을 예측하고 있다. 이는, scFv에 있어서 링커 길이가 12 이하인 경우, 일반적으로 인접하는 VH와 VL은 Fv를 형성하기 어려운(즉 모노머를 형성하기 어려운) 것이 보고되어 있기 때문이다. 그러나, 비특허문헌 2에 있어서, 링커 길이가 10 또는 5인 Fv에 있어서도 소량이지만 모노머가 형성되는 것이 보고되어 있고, 비특허문헌 10에 있어서의 링커 길이가 5-15-5 또는 15-5-15인 경우에 있어서도, 얻어진 sc(Fv)2는 반드시 100%의 단일 사슬 디아바디 또는 2가 scFv의 구조라고는 할 수 없다. 지금까지의 보고에서는 구조 이성체에 관해서는 Fv의 조합과 링커 길이로부터의 구조 예측 뿐으로, 구조 이성체의 함유비율의 정량적 분석이나 얻어진 구조가 목적한 구조인지 여부의 확인·증명은 행해져 있지 않아, 구조 이성체가 충분히 평가 및 제어되어 있다고는 할 수 없다. 즉, 어떠한 링커 길이의 sc(Fv)2에 있어서도 Fv의 조합과 링커 길이로부터는 구조 이성체의 존재비를 예측하는 것은 매우 곤란하고, 2조(組)의 VH, VL을 갖는 sc(Fv)2형 분자에 있어서는 2개의 구조 이성체의 존재는 고려해야 할 문제이다. 저분자 화합물에 관해서는 광학 이성체나 기하 이성체의 분리방법은 다수 알려져 있지만, 지금까지 단백질의 이성체를 분리하는 방법은 보고되어 있지 않다. 단백질의 1 아미노산의 차이를 분리하는 방법은 이미 다수 보고되어 있지만, 완전히 동일한 아미노산 1차 서열을 갖는 2개의 구조적인 이성체를 분리하는 방법은 지금까지 보고가 없다. sc(Fv)2의 구조 이성체에 관해서도 마찬가지로, 종래기술에서는 sc(Fv)2의 2종류의 구조 이성체의 분리분석법, 확인방법은 지금까지 존재하지 않았다. 지금까지 sc(Fv)2의 구조 이성체의 분리방법이 존재하지 않았던 측면에서, 2종류의 구조 이성체 사이에서의 활성의 차이에 착안한 보고는 없다. 이중특이성 sc(Fv)2에 있어서는 구조 이성체에 의해 바른 Fv의 조합과 바르지 않은 Fv의 조합 사이에서 활성이 크게 상이한 것은 당연히 예상되지만, 단일특이성(Monospecific) sc(Fv)2에 있어서는 동일한 2가인 구조 이성체 사이에서 활성의 차이에 관해서는 예상하기 어렵다. 비특허문헌 10에 있어서는 2개의 구조 이성체 사이에서 활성이 상이할 가능성은 고려하지 않고, 활성(결합활성)은 구조 이성체의 혼합물로 측정하고 있다. 이는 sc(Fv)2의 구조 이성체의 분리 정제의 곤란함으로부터, 각각의 구조 이성체를 고순도로 조제하여 활성을 엄밀하게 비교할 수 없었기 때문이다. 링커 길이를 개변한 sc(Fv)2에 있어서도, 링커 길이로부터 상정되는 2개의 구조 이성체를 각각 모델 예측이 아니라 "동정(同定)"하고, 그 구조 이성체의 함유비율을 정량적으로 평가하는 것은 지금까지 불가능하였다. 그 때문에, sc(Fv)2의 링커 길이와 구조 이성체의 함유비율의 관계를 명확히 한 정량적인 검토는 지금까지 실시되어 있지 않고, 실질적으로 링커 길이에 의해 구조 이성체의 함유비율을 컨트롤한 보고는 없다. 링커 길이를 변화시키는 것은 sc(Fv)2의 2개의 항원결합 부위간 거리를 바꾸는 것이 되기 때문에, 링커 길이는 그 생물활성(특히 리셉터를 이량체화하는 아고니스트 활성)에 영향을 미칠 가능성이 있다. 그 때문에 항원의 종류에 따라 2개의 항원결합 부위간 거리는 링커 길이에 따라서 임의로 조절 가능한 것이 바람직하다. 또한, 링커 길이는 안정성에 크게 영향을 미치는 것이 보고되어 있고(비특허문헌 1, 비특허문헌 2), scFv에서는 일반적으로 링커가 짧을수록 안정성이 낮은 것이 알려져 있다. sc(Fv)2에 있어서도 동일하게 생각되고, 중앙의 링커를 짧게 함으로써 회합체(dimer)가 생성되기 쉬워지는 것이 보고되어 있으며(비특허문헌 6), 안정성이 높은 sc(Fv)2를 제작하기 위해서는 링커 길이는 임의로 조절 가능한 것이 바람직하다. 이와 같은 측면에서, sc(Fv)2를 의약품으로서 개발하는 경우, 임의의 링커 길이에 있어서 목적하는 구조 이성체를 단리할 수 있는 것이 바람직하다고 생각된다. 그러나, 지금까지 임의의 링커 길이를 갖는 sc(Fv)2에 있어서, 2가 scFv와 단일 사슬 디아바디의 2종류의 구조 이성체를 각각 단리한 보고는 없다. 이미 항 인간 Mpl 항체의 sc(Fv)2가 TPO 유사 아고니스트 활성을 나타내는 것이 보고되어, sc(Fv)2가 의약품이 될 수 있는 것이 명확해져 있다(비특허문헌 12). 구조 이성체를 포함하는 sc(Fv)2를 의약품으로서 개발하기 위해서는, 목적하는 구조 이성체만을 분리 정제하여 구조 이성체의 한쪽만을 포함하는 원약(原藥)을 제조하는 것, 또는 원약이 구조 이성체 혼합물인 경우에는 2종류의 구조 이성체의 성질을 결정하고, 각 구조 이성체의 함유비율을 정량적으로 분석하는 규격시험을 실시하는 것이 필요해진다. 그러나, 지금까지 sc(Fv)2의 구조 이성체의 분리 정제·정량적 분석·구조 동정하는 방법은 알려져 있지 않다. 또한, 링커 길이에 따른 scFv의 모노머/다이머/트리머/테트라머의 존재비율을 제어하는 방법이 보고되어 있지만, sc(Fv)2의 구조 이성체에 관해서는 전술한 바와 같이 구조 이성체의 정량적 분석법이 발견되어 있지 않기 때문에, 링커 길이에 따른 구조 이성체 존재비율의 제어방법은 지금까지 보고되어 있지 않다. 비특허문헌 1 : Protein Engineering, 1993, 6(8), 989-995 비특허문헌 2 : Protein Engineering, 1994, 7(8), 1027-1033 비특허문헌 3 : Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374 비특허문헌 4 : Journal of Immunology, 1995, 154, 4576-4582 비특허문헌 5 : PNAS, 1995, 92, 7021-7025 비특허문헌 6 : Journal of Molecular Biology, 1999, 293, 41-56 비특허문헌 7 : Protein Engineering, 2001, 14(10), 815-823 비특허문헌 8 : Journal of Molecular Biology, 2003, 330, 99-111 비특허문헌 9 : Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66 비특허문헌 10 : Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281 비특허문헌 11 : Int. J. Cancer, 1998, 77, 763-772 비특허문헌 12 : Blood, 2005, 105, 562-566