바이오필름 감염에 대한 항생제 선택용 플레이트 document_id A220623063304

미생물의 특성 결정은 관습적으로, 회분 배양 (batch culture) 연구 방법을 이용하였으며, 여기서, 유기체는 분산되거나 부유된 상태로 존재한다. 지난 25년에 걸쳐, 많은 환경에서 박테리아 바이오매스의 주요 성분은 고착성 박테리아인 것으로 인식되었다. 미생물 생태학 분야에서 최근의 기술적 진보로 인해 세균이 실질적으로 자연상태 및 질환에 존재하는 경우의 세균의 면밀한 연구가 가능해졌다. 이러한 연구는 대부분의 미생물이 바이오필름에서 성장할 수 있으며, 바이오필름에서의 유기체의 성장은 회분 배양시 동일한 유기체의 성장과 물리적 및 생리학적으로 상이하다는 것을 보여주었다. 이러한 차이는 이들 유기체의 병인 및 항균제에 대한 이들의 민감성 둘 모두에서의 관찰된 변화에 기여한다. 항생제 내성은 일반적으로 미생물 생태의 변화 및 보호성 엑소폴리사카라이드 매트릭스의 생성에 기인한다. 그램-네거티브 로드인 P. 애루기노사 (P. aeruginosa)는 매우 다양한 산업, 상업 및 처리 작업시 예컨대, 하수도, 재활수 시스템 (냉각 타워, 에어 컨디셔닝 시스템 등), 물 응축 콜렉션, 페이퍼 펄핑 작업 및 일반적으로, 물 함유, 조작, 치료, 수집, 등의 시스템에서 발견되는 많은 유기체중 하나이다. 바이오필름은 물 조작 시스템에서 편재되어 있기 때문에, P.애루기노사가 또한, 이들 바이오필름과 관련되어 발견된다는 것은 놀랍지 않다. 많은 경우, P.애루기노사는 주요 미생물 요소이다. 산업 공정에서의 중요성에 더하여, P.애루기노사 및 이의 관련 바이오필름 구조는 광범위한 의학적 관계를 가지며, 많은 병인론적 질병의 기초가 된다. P.애루기노사는 다양한 감염과 관련되며, 예를 들어, 낭포성 섬유증을 갖는 환자의 폐를 만성적으로 콜론화시키는 기회감염 박테리아이다. 바이오필름으로서 성장하는 슈도모나스 애루기노사는 항생제에 매우 내성이며, 식세포에 내성이다. 본 발명자들은 바이오필름을 제거하고 제어하는데 효과적인 항-바이오필름 제제 및 항-바이오필름 제제 조합을 선별하기 위한 특정 목적을 갖는 검정법을 개발하였다. 특히, 슈도모나스 애루기노사 바이오필름에 대한 장치 및 방법을 개발하였다. 이러한 생산물은 낭포성 섬유증 폐 감염 및 기타 슈도모나스 감염을 갖는 환자에 대한 항균 약물 치료법 선택을 개선시켜야 한다. 이들 기면에 존재하는 유기체는 많은 병인성 및 비병인성 박테리아 및 진균류를 포함한다. 스타필로코커스 spp. (Staphylococcus spp.) 감염은 스테인레스 강철, 실리콘, 폴리우레탄으로 이루어진 이식된 의료 장치와 주로 관련이 있다. 이식된 의료 장치는 먼저 글리코단백질 예컨대, 피브로넥틴으로 피복되며, 이는 스타필로코커스 유기체가 기면에 접착되어, 종국에는 미생물 바이오필름을 형성하게 한다. 스타프 (Staph)는 의료 장치와 관련된 경우 항생제 치료에 반응하지 않는 것으로 널리 인식되어 있다. 고착성 박테리아에 대한 항미생물 활성의 평가는 스타프 감염에 대해 의학적 효력을 더욱 잘 예측해야 한다. 병원성 진균류 예컨대, 캔디다 (Candida) 및 애스퍼길루스 푸미가투스 (Aspergilus fumigatus)는 현재 중요한 감염물로서 인식되어 있으며, 현저한 사망율의 원인이다. 종종 이들은 이식된 장치와 관련있으며, 면역저하된 환자와 관련있다. 최근에는, 치료 실패가 바이오필름의 형성과 관련있는 것으로 인식되었다. 항진균제에 대한 내성 유전자가 기술되어 있지만, 치료 실패에 있어서 바이오필름 모드의 성장에 기초한 생리학적 내성은 동일하거나 더욱 현저할 수 있다. 바이오필름 형태의 박테리아가 부유형 박테리아 보다 항박테리아 제제에 더욱 내성이라는 것은 널리 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 바테리아의 존재 및 박테리아에 대한 항생제 효력에 대한 시험은 전형적으로 부유형 박테리아에 대한 시험과 관련된다. 연구는 부유 (자유 부유) 상태의 박테리아와 비교한 경우, 바이오필름의 항생제에 대한 내성이 100배를 초과한다는 것을 보여주었다. 이러한 내성은 개발된 뮤코폴리사카라이드 코팅을 포함하나 이에 제한되지 않은 바이오필름 모드 성장의 일부로서의 많은 표현형 변화 및 미생물의 생리학적 변화로 인해 다요인적이다. 바이오필름 감염을 치료하기 위한 항생제 및 항생제 조합의 선택은 최소 억제 농도 (MIC) 검정법의 효율성이 부족한 것으로 인식되었음에도 불구하고 이러한 시험에 여전히 의존적이다. 일부는 바이오필름 억제 농도 (BIC)를 사용할 것을 제안하였으나 (Moskowitz, et al.; J.Clin. Microbiology, 42:1915-1922 (May 2004)), 이러한 증거는 BIC 및 MIC 둘 모두가 고착성 박테리아에 대한 것이 아니라 부유 박테리아에 대한 것임을 시사한다. 예를 들어, 모스코비츠 등은 이들 공정시 원심분리를 이용하였으며, 시험된(challenged) 바이오필름으로부터 유래된 대다수의 세포를 제거하지 않았으며, 따라서 부유 박테리아 단독에 대한 검정 결과이거나 단지 일부의 바이오필름 검정 결과에 해당한다. 따라서, 이러한 검정은 페그(peg)상에 남아있는 생존가능한 세포를 놓치고 있으며, 따라서 잠재적으로 부정확한 결론에 도달하게 된다. 또한, 종래 기술은 전형적으로 정적 (비-유동) 환경하에서 바이오필름을 성장시키며, 이는 때때로 결과에 영향을 끼친다. 이에 반하여, 본 발명에 따른 공정에 있어서는, 초음파 처리 또는 별도의 회수 플레이트상에서의 재성장한 바이오필름을 사용하였으며, 따라서 완전한 본래의 바이오필름이 수득될 수 있으며, 검정될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 공정은 동적이거나 유동 환경하에서 바이오필름을 성장시키고 항균제를 중화시키는 것을 포함하며, 이는 개별적으로 또는 종합적으로 검정 결과를 뒷받침한다. 따라서, CF 폐 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 및 동물에서의 바이오필름 매개된 질환에 효과적인 항-바이오필름 조성물을 포함하는, 바이오필름에 대해 효과적인 조성물을 선택하기 위한 개선된 처리 및 검정 장치 및 방법이 요구된다. 본 발명의 요약 본 발명은 바이오필름에 대해 효과적인 단독의 또는 조합된 하나 이상의 활성제를 선택하는 방법 및 장치를 개선시켰다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 장치 및 방법은 바이오필름 감염의 치료에 사용될 수 있다. 바이오필름은 임의의 바이오필름 예를 들어, 박테리아, 진균류 또는 조류, 및 기생충으로부터 형성된 것; 또는 생성될 때 바이오필름내에 혼입된 미생물; 또는 혼합된 바이 오필름 예를 들어, 하나 초과의 박테리아, 바이러스, 진균류, 기생충 또는 조류 바이오필름을 함유하는 바이오필름일 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 치료 프로토콜을 개발하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 치료 프로토콜은 특정 환자에 맞춰질 수 있고/거나 개인적 의학 치료법 또는 방법 개발의 기초를 형성할 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한, 슈도모나스 애루기노사, 스타필로코커스 ssp., 캔디다 ssp., 및 애스퍼길루스 푸미가투스를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 미생물 치료에 효과적이다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한, 하나 이상의 바이오필름에 의해 매개된 다양한 질환 및 질병을 치료하는데 효과적이며, 상기 질환은 낭포성 섬유증 (CF)을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 하나 이상의 박테리아, 바이러스, 진균류, 기생충, 조류 또는 이들의 복합물에 의해 매개되거나 초래된 질병 및 질환을 포함한다. 본 발명은 또한, 특정 바이오필름 또는 바이오필름들을 성장시키고, 이러한 바이오필름에 대해 효과적인 적합한 활성제 또는 활성제들을 결정하도록 맞춰지는 의학적으로 중요한 검정법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 검정법은 최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC), 최소 억제 농도 (MIC) 또는 최소 살균 농도 (MBC) 또는 이의 조합을 제공한다. 본 발명은 바이오필름에 대한 효력을 갖는 하나 이상의 활성제를 함유하는 조성물을 선택하기 위한 개별적 및/또는 조합된 활성제의 패널을 제공한다. 이러한 활성제 또는 활성제 조합은 환자-특이적 감염성 유기체를 처리하는데 유용할 수 있다. 본 발명은 바이오필름 관련된 감염성 질환의 복합적 항생제 치료법을 선택하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한, 개별적 환자에 대해 특이적인 약제 조성물을 결정하고 개발하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 널리 공개된 항생제 내성의 원인이 되는 현존하는 치료법에 대한 대안을 제공한다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한, 특정 환자에 맞춰진 적합한 치료 프로토콜 개발 과정에서의 유전자 변화, 유전자 이동 및 항생제 내성을 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 바이오필름의 존재에 맞춰진 실험관내 검정법 즉, 최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC) 측정에 기초한 검정법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 장치 및 방법은 MBEC, 최소 억제 농도 (MIC), 및 최소 살균 농도 (MBC) 값의 조합을 제공한다. 본 발명의 장치 및 방법은 하기중 하나 이상에서 종래 장치에 비해 개선되었다: 본 장치 및 공정은 본래의 바이오필름을 시험하고; 본래의 바이오필름을 제거하기 위해 초음파 처리를 이용하는 것을 포함하며; 장치 및 공정은 넓은 범위의 바이오필름 예를 들어, 진균류 등에 적용되며; 항-바이오필름 제제는 살균제 등을 포함하는 더 넓은 범위의 제제에 망라하며; 장치 및 방법은 높은 처리량을 가져, 더욱 효율적이고 비용 효과적이며; 향상된 바이오필름 성장을 위한 처리 조건에 대한 이해 및 적용이 증대된 것을 포함하여, 바이오 필름 성장이 개선되었다. 세균 바이오필름은 많은 의학적, 수의학적, 농업적 및 산업적 시스템, 처리, 공정 장치 및 기면에 존재한다. 이러한 기면에 존재하는 유기체는 많은 병인성 및 비병인성 바이오필름을 포함한다. 본 발명의 방법 및 장치는 이들이 발생하는 곳마다 예를 들어, 오염이 발생하는 산업 처리장 예를 들어, 오염 제거 펄프 및 페이퍼 분쇄 장치, 기체/오일 처리 파이프 라인, 및 오염 제거 음식 처리 장치, 또는 카테터, 힙 이식물 및 캐뉼라를 포함하는 이식된 의료 장치에서 바이오필름을 분해하는데 사용될 수 있다. 본원에 개략된 원리가 또한, 바이오필름이 발생하는 모든 환경하의 모든 바이오필름에 적용된다는 것은 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명은 또한, 일체화된 장치 (device) 또는 어셈블리 (assembly), 다수의 어셈블리, 다수의 서브-어셈블리, 또는 이들의 복합물의 용도를 포함한다. 본 발명의 이러한 및 기타 양태는 하기 도면, 설명 및 청구범위에 의해 자명해질 것이다. 도면의 간단한 설명 도 1은 용기 리드상의 다수의 바이오필름 접착 부위의 하면이다. 도 2는 도 1의 다수의 바이오필름 접착 부위의 수용하는 용기의 상면이다. 도 3은 도 1 및 2의 리드 및 용기의 부분적으로 생략된 측면도이다. 도 4는 본 발명의 예시적 구체예인 처리 단계의 흐름도이다. 도 5는 본 발명의 바이오필름 성장 및 형성 공정의 예를 나타낸다. 도 6은 본 발명의 바이오필름 민감성 검정법의 예이다. 도 7은 본 발명에 따른 본래의 바이오필름을 회수하기 위한 공정의 예이다. 도 8은 본 발명에 따라 MBEC 및 MIC 측정치를 확립하기 위한 공정의 예이다. 도 9는 실시예 6에 기술된 실험의 결과 차트이다. 도 10은 실시예 7에 사용된 시험 플레이트(challegne plate)의 구성을 나타낸다. 도 11은 실시예 10에 사용된 시험 플레이트의 구성을 나타낸다. 도 12는 측정된 바이오필름의 MIC, MFC 및 MBEC 값의 챠트이다.