인간 배아 줄기 세포의 생성을 위한 인간 난모 세포의 처녀생식에 의한 활성화 방법 document_id A220623064537

배경에 관한 정보 인간 배아 줄기 세포(ES)는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있는 다능성 세포(pluripotent cell)이다. 배아 줄기 세포가 면역 결핍성 마우스에 주입될 때, 이 세포는 분화된 종양(기형종)을 형성한다. 그러나, 시험관 내에서 유도되어 배상체(embroid body; EB)를 형성하는 배아 줄기 세포는, 임의의 성장 조건 하에서, 몇몇 조직의 특성을 갖는 다수의 세포 유형으로 분화되기 쉬운 배아 줄기 세포주의 공급원이 된다. 예를 들어, ES 세포는 신경 성장 인자와 레티논산이 존재할 때 뉴런으로 분화된다. 인간 ES 세포와 이의 분화된 자손은 치료를 위한 이식과 약물 실험 및 개발용으로서 정상적인 인간 세포의 중요한 공급원이다. 이와 같은 목적들을 위해서는, 환자의 요구에 적합하거나 또는 적당한 약물 실험에 적당한 조직 유형으로 분화되는 세포를 충분히 공급해야 한다. 이와 관련하여, 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 생산하는 효율적이고도 신뢰성이 있는 방법이 필요하다. 최근 들어, 인간 배아 줄기 세포(hES)는 3가지 공급원으로부터 얻는다: 불임 처리 후 잔류하거나 연구를 위해 기증되는 배반포, 공여된 배우체(난모 세포 및 정자)로부터 생산된 배반포, 그리고 핵 운반(NT)의 결과물. 사망한 태아의 조직은 인간 배아 생식 세포(hEG)의 유일한 공급원이다. hES 세포 및 hEG 세포는 놀라운 과학적 가능성과 치료 가능성 예를 들어, 보다 특화된 세포나 조직을 생산할 수 있는 기능성을 제공한다. 그러나, hES 세포 및 hEG 세포의 공급원에 대한 윤리적인 문제와, 연구의 목적으로 NT를 사용하기 시작하면 인간 피험체를 생산하는데에도 NT를 사용할 수 있을 것이라는 우려는 전 인류적 논쟁과 분쟁의 소지가 되고 있다. 배아 줄기 세포 생산용 난모 세포를 제조하는데 있어서, 포유동물의 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 방법은, 정자/NT에 의해 수정시키는 방법의 대안으로 사용될 수 있다. 처녀 생식에 의한 활성화란, 수컷 배우체를 사용하지 않고서도 암컷 배우체로부터 성체를 영구적으로 또는 비 영구적으로 발생시켜 배세포를 생산하는 방법을 말한다. 포유동물 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화는 다양한 방법으로 유도되고 있다. 이 과정을 활성화시키기 위하여 전기 자극을 사용하는 방법이 특히 많이 사용되고 있는데, 그 이유는 전기 주입법이 현재 핵 운반 방법의 일환을 이루고 있기 때문이다. 배 세포-난모 세포막 융합에 사용되는 전기 주입 장치를 이용하여 전기 자극을 줌으로써, 시험관 내에서 처녀 생식에 의한 활성화를 일으키는 방법이 보고된 바 있다. 마우스의 난모 세포는 Ca2+-Mg2+는 함유하지 않고, 히알유로니다제를 함유하는 배지에 노출시키고, 에탄올, Ca2+ 이오노포어 또는 킬레이트화제, 단백질 합성 억제제 및 전기 자극에 노출시킴으로써 활성화된다. 이러한 과정들은 처녀 생식에 의한 활성화 속도와 마우스 난모 세포의 발생 속도를 촉진하긴 하지만, 어린 소의 난모 세포의 발생은 활성화하지 않았으며/않았거나, 심지어는 이의 속도를 늦추기까지 하였다. 또한, 마우스 난모 세포의 수정 및 처녀 생식에 의한 활성화는 배란 후 성숙에도 의존적이다. 소의 난모 세포를 에탄올, 전기 자극 및 실온에 노출시키고, 전기 자극과 사이클로헥시미드에 의한 단백질 억제를 함께 일으켜 활성화하는 방법에 관하여도 보고된 바 있다. 이러한 방법들은 세포 내 Ca2+ 농도를 증가시키는 것으로 생각되며, 난모 세포가 28시간 이상 성숙하였을 때 가장 성공적이다. 발명의 개요 본 발명은 어떠한 조건이 인간 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는데 최적인지를 발생학적으로 관찰한 결과를 바탕으로 한다. 하나의 구체예에서, 인간 줄기 세포를 생산하는 방법은 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 과정을 포함하는데, 여기서, 활성화 과정은 높은 산소(O2) 분압 하에서 난모 세포와 이오노포어를 접촉시키는 단계와, 낮은 O2 분압 하에서 난모 세포와 세린-트레오닌 키나제 억제제를 접촉시키는 단계, 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 활성화된 난모 세포를 배양하는 단계, 이 배반포를 영양 세포층으로 운반하는 단계, 그리고 운반된 배반포를 높은 O2 분압 하에서 배양하는 단계, 배반포의 영양외배엽 세포로부터 내부 세포괴(inner cell mass: ICM)를 물리적으로 분리하는 단계, 그리고 이 ICM의 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계[여기서, ICM 세포는 높은 O2 분압 하에서 배양됨]를 포함한다. 바람직하게, 난모 세포는 인간의 것이다. 관련 측면에서, O2 농도 약 2%∼약 5% O2인 혼합 기체 환경에서 항온 처리함으로써 낮은 O2 분압이 유지되며, 이 경우, 혼합 기체 환경은 약 5%의 CO2와 약 90∼93%의 질소(N2)를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 인간의 중기 II 난모 세포를 활성화하는 방법은, 높은 O2 분압 하, 시험관 내 수정(IVF) 배지 중에서 인간의 중기 II 난모 세포를 항온 처리하는 단계, 이 세포를 높은 O2 분압 하에서 이오노포어를 포함하는 IVF 배지 중에서 항온 처리하여 활성화하는 단계, 그리고 낮은 O2 분압 하, 세린-트레오닌 키나제 억제제(STKI)를 포함하는 IVF 배지 중에서 이 세포를 항온 처리하는 단계와, 배반포가 낮은 O2 분압 하에서 형성될 때까지 이 STKI 처리된 세포를 항온 처리하는 단계[여기서, 배반포로부터 얻어진 세포 덩어리(ICM)는 배양 가능한 줄기 세포를 생산함]를 포함한다. O2 분압은, CO2 약 5%, O2 약 20%, 그리고 N2 약 75%인 혼합 기체 환경 하에서 세포를 항온 처리함으로써 높게 유지될 수 있다. 관련 측면에서, 활성화 이후에 수행되는 항온 처리 단계에 있어서의 O2 분압은, O2 농도 약 2∼약 5% O2인 혼합 기체에서 세포를 항온 처리함으로써 유지되는데, 여기서, 이 혼합 기체 환경은 약 5%의 CO2와 약 90∼약 93%의 N2를 추가로 포함한다. 다른 관련 측면에서, IVF 배지는 본질적으로 인간의 것이 아닌 생산물을 포함하지 않는다. 추가의 관련 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 생산되어 분리된 난모 세포가 제공되는데, 이는 난모 세포로부터 제조되어 분리된 내부 세포괴(ICM)와, 이로부터 분리된 해당 줄기 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 배아 줄기 세포와 이의 분화된 자손을 생산하는 포유동물 난모 세포의 인간 처녀 생식에 의한 활성화 방법이 제공된다. 이러한 세포들과 자손은 실질적으로 난모 세포 공여체와 동계의 것으로서, 난모 세포 공여체와 관련된 세포의 자기 이식이 가능하므로, 통상적으로 난모 세포 공여체의 면역계에 의한 거부 현상이 일어나지 않을 수 있다. 관련 측면에서, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유래한 hES 세포주의 세포 은행이 제공된다. 하나의 구체예에서, 냉동 보존된 난모 세포 또는 반수성체(parthenote)로부터 인간 줄기 세포를 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은, 난모 세포 또는 반수성체의 세포질에 냉동 보존제를 미세 주입하는 단계, 난모 세포 또는 반수성체를 극저온으로 동결시켜 이 세포들을 휴지기 상태로 만드는 단계, 이 난모 세포 또는 반수성체를 휴지기 상태로 저장하는 단계, 난모 세포 또는 반수성체를 해동하는 단계, 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 단계[여기서, 활성화 과정은, 높은 O2 분압 하에서 이오노포어와 난모 세포를 접촉시키는 단계와, 낮은 O2 분압 하에서 세린-트레오닌 키나제 억제제와 난모 세포를 접촉시키는 단계를 포함함], 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 반수성체 또는 활성화된 난모 세포를 배양하는 단계, 배반포의 영양외배엽 세포로부터 내부 세포괴(ICM)를 분리하는 단계, 그리고 이 ICM의 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계[여기서, 이 배양 과정은 높은 O2 분압 하에서 수행됨]를 포함한다. 다른 구체예에서, 인간 공여자로부터 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유래하는 자기 줄기 세포가 제공된다. 하나의 측면에서, 줄기 세포는 공여 세포와 실질적으로 동일하게 반수체형(haplotype)이다. 관련 측면에서, 줄기 세포는 실질적으로 공여 세포와 유전학적으로 동일하다. 하나의 측면에서, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 마커에 의하면 줄기 세포는 공여체의 완전한 형제자매인 것으로 확인된다. 다른 측면에서, 줄기 세포는 공여체 기원에 따라서 게놈상 각인되어 있다. 하나의 구체예에는, 인간 공여자로부터 유래하며, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포에서 얻어진 줄기 세포에서 생산된 분화 세포가 개시되어 있다. 관련 측면에서, 분화된 세포로서는 뉴런 세포, 심장 세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 내피 세포, 조골 세포, 희소돌기아교세포, 조혈모세포, 지방 세포, 기질 세포, 연골 세포, 성상 세포, 수지상 세포, 각질 세포, 췌장도 세포, 림프계 전구 세포, 비만 세포, 중배엽 세포와 내배엽 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 관련 측면에서, 분화된 세포는 하나 이상의 마커 예를 들어, 신경 미세 섬유 68, NCAM, 베타 III-튜불린, GFAP, 알파-액티닌, 데스민, PECAM-1, VE-카데린, 알파-페토프로테인을 발현하거나 또는 이것들을 함께 발현한다. 다른 구체예에는, 자기 줄기 세포를 포함하는 세포주가 개시되어 있는데, 여기서, 상기 줄기 세포는 인간 공여자로부터 유래하며, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어지는 것이다. 하나의 측면에서, 세포는 SSEA-1을 발현하지 않는다. 다른 측면에서, 세포주의 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽 생식 계통으로 발생한다. 하나의 구체예에는, 세포 은행이 냉동 보존된 반수성체를 포함하는 것으로 개시되어 있는데, 여기서, 상기 반수성체는 한 사람의 인간 공여자로부터 유래하는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어지는 것이다. 관련 측면에서, 반수성체는 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 배양된다. 하나의 구체예에는, 세포 은행이 냉동 보존된 자기 줄기 세포를 포함하는 것으로 개시되어 있는데, 여기서, 상기 줄기 세포는 하나 이상의 인간 공여자로부터 유래하는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어지는 것이다. 다른 구체예에서, 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하는 방법은, 분화된 세포를 포함하는 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 분화된 세포는 인간 공여자로부터 유래하는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어진 줄기 세포로부터 생성되는 것이다. 하나의 측면에서, 분화된 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 내피 세포, 조골 세포, 희소돌기아교세포, 조혈모세포, 지방 세포, 기질 세포, 연골 세포, 성상 세포, 수지상 세포, 각질 세포, 췌장도 세포, 림프계 전구 세포, 비만 세포, 중배엽 세포와 내배엽 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포이다. 관련 측면에서, 피험체는 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, ALS, 척수 결손 또는 손상, 다발성 경화증, 근위축증, 낭포성 섬유증, 간 질환, 당뇨병, 심장 질환, 망막 질환(예를 들어, 황반 변성증 및 색소성 망막염), 연골 결손 또는 손상, 화상, 족부 궤양, 혈관 질환, 요로 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병이 발병한 환자이다. 하나의 구체예에는, 클로닝된 인간 배아 줄기 세포를 생산하는 방법이 개시되어 있는데, 이 방법은, 이미 수정된 인간의 난모 세포로부터 제1 전핵을 제거하는 단계, 제2 전핵을 상기 제핵 난모 세포로 운반하는 단계[여기서, 상기 제2 전핵은 공여자 난모 세포 또는 공여자의 모친으로부터 유래하는 난모 세포, 또는 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유래하는 것이며, 상기 난모 세포의 전핵은 활성화 이전에 공여자의 체세포 핵으로 치환됨], 그리고 배반포가 형성될 때까지 상기와 같이 생성된 난모 세포를 배양하는 단계[여기서, 상기 배반포로부터 유래하는 내부 세포괴는 배아 줄기 세포를 함유함]를 포함한다. 본 발명에 의한 대표적 방법과 조성물에 관하여는 이하에 자세히 기술되어 있다. 도면의 간단한 설명 도 1a는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포에 있어서 알칼리성 포스파타제의 표면 마커 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1b는 표면 마커 Oct4의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1c는 표면 마커 SSEA-1의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1d는 표면 마커 SSEA-3의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1e는 표면 마커 SSEA-4의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1f는 표면 마커 TRA-1-60의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1g는 표면 마커 TRA-1-81의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 2a는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포의 텔로머라제 활성을 분석한 결과이다. 500, 1000 및 10000 (유닛)의 추출물을 사용하여 분석을 수행하였다. ΔH - 열 처리된 테스트 추출물(네거티브 대조군); 포지티브 대조군 - 텔로머라제 보유세포; CHAPS-용해 완충액; TSR8-대조군 주형. 도 2b는 9일 동안 배양한, 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포에서 생성된 배상체의 현미경 사진이다. 도 2c는 10일 동안 배양한, 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포에서 생성된 배상체의 현미경 사진이다. 도 2d는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포의 핵형을 나타내는 것이다. 도 2e는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포의 DNA 핑거 프린팅(DNA finger printing) 분석 결과를 나타내는 것이다. 1 → 난모 세포 공여자의 혈액으로부터 얻은 DNA; 2 → 동일한 공여자로부터 유래하는 처녀 생식 hES 세포로부터 얻은 DNA; 3 → 인간 영양 섬유아세포로부터 얻은 DNA. 도 3은 게놈 각인(genomic imprinting)과 관련된 유전자 발현의 특성을 나타내는 노던 블럿 결과를 나타내는 것이다. DNA 프로브: SNRPN, Peg1_2, Peg1_A, H19 및 GAPDH(내부 대조군). NSF, 신생아 피부 섬유아세포; hES, 수정된 난모 세포로부터 유래하는 인간 배아 줄기 세포주; 1, phESC-1; 2, phESC-3, 3, phESC-4, 4, phESC-5; 5, phESC-6; 6 phESC-7. NSF RT-, hES RT-, 1RT- 는 네거티브 대조군이다. 도 4는 phESC를 3개의 모든 생식 세포층의 유도체로 분화시킨 결과를 나타내는 것이다. 외배엽이 분화되었는지는, 뉴런 특이적 마커 68(A), NCAM(B), 베타 III-튜불린(C) 및 아교 세포 마커 GFAP(D, M)가 면역 세포학적 염색이 된 것을 통해 확인된다. 분화된 세포는 중배엽 마커: 근육 특이적 알파 액티닌(G) 및 데스민(J), 내피 세포 마커 PECAM-1(E) 및 VE-카데린(F)을 보유하였다. 내배엽이 분화되었는지는 알파-페토프로테인(H, L)이 염색된 것을 통해 확인된다. 상기 phESC는 색소성 내피-유사 세포(I, K)를 생산한다. 배율:(I), ×100; (A∼H, J∼M), ×400. 도 5a∼5b는 특이적 마커에 대한 phESC 세포주의 특성 규명 결과를 나타내는 것이다. 인간 영양 세포층 상 미분화 phESC 콜로니(A∼F), SSEA-1이 염색되지 않은 경우(G∼L), 세포 표면 마커인 SSEA-3 및 SSEA-4가 발현된 경우(각각 M∼R 및 S∼X). 배율: (A)∼(E), ×100; (F), ×200; (G)∼(X), ×400. 영양 세포(A-F), OCT-4(G∼L), TRA-1-60(K∼R) 및 TRA-1-81(S∼X)에서 phESC 콜로니가 알칼리성 포스파타제에 의해 염색됨. 배율: (A, B, O, R), ×100; (C-F, M, S, X), ×200; (G-L, N, P, Q, T-W), ×400. 도 6은 포지티브 대조군과 비교하였을 때, phESC 세포가 텔로머라제 활성을 높은 수준으로 나타냄을 입증하는 것이다: "+" = 500개의 세포로부터 유래하는 추출물; "-" = 불활성화된 텔로머라제를 사용하여 얻어진, 열 처리된 세포 추출물; "대조군 +" = 텔로머라제 활성을 나타내는 세포 추출물(트라페즈 키트(TRAPEZE Kit) 사용); "B" = CHAPS 용해 완충액, 프라이머-이량체/PCR 오염 대조군; TSR8-텔로머라제 정량 대조군 주형(0.1 및 0.2 mole/㎕); "M" = 마커, DNA 사다리. 도 7은 phESC 세포주의 G-밴드 핵형을 나타내는 것이다. phESC-1(A), phESC-3(B), phESC-4(C), phESC-5(D) 및 phESC-6(E) 세포주는 정상적인 46번, XX 핵형을 갖는다. phESC-7 세포주는 47번, XXX 핵형을 갖는다(F).