표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트 document_id A220623065274

혈관신생생성 즉, 새로운 혈관의 생성은 배발달 및 정상 조직 성장 및 복구 동안 뿐만 아니라, 암컷의 번식주기, 임신의 성립 및 유지, 상처 및 골절의 복구 동안에 발생한다. 정상적인 개체에서 발생하는 혈관신생생성 이외에, 혈관신생생성은 많은 병리학적 과정 특히, 종양 성장 및 전이, 및 혈관 증식이 증가하는 다른 질병 예컨대, 당뇨병성 망막병증, 건선 및 관절병에 관련된다. 또한, 혈관신생생성은 증식성 성장에서 종양성 성장으로의 종양의 전이에 중요한 역할을 한다. 결론적으로, 혈관신생생성의 억제는 활성 암 치료 연구 분야에 속한다. 종양 유도된 혈관신생생성은 종양 세포에 의한 혈관신생 촉진 성장 인자의 생성에 의존적인 것으로 여겨지며, 이는 존재하는 혈관을 무활동화시키고 안정화시키는데 작용하는 다른 동력을 압도한다. 이러한 혈관신생 촉진제 또는 성장 인자의 가장 우수하게 특징지어진 것은 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF)이다 (Cohen et al., FASEB J. 13: 9-22 (1999)). VEGF는 저산소증 및 일부 다른 자극에 반응하는 다양한 세포 유형에 의해 자연적으로 생성된다. 많은 종양 또한, 다량의 VEGF를 생성하고/거나 스트로마 세포 근처에서 VEGF를 유도한다 (Fukumura et al., Cell, 94:715-725 (1998)). VEGF-A로서 불리는 VEGF는 121, 145, 165, 189 및 206개 아미노산의 5개의 상이한 스플라이스 이성체로서 합성된다. VEGF121 및 VEGF165는 특히, 종양에서 생성되는 주요 형태이다 (문헌 [Cohen et al. 1999, supra] 참조). VEGF121는 VEGF 유전자의 엑손 6 및 7에 의해 엔코딩된 기본 도메인이 결여되어 있으며, VEGF165와 달리 헤파린 또는 세포외 매트릭스에 결합하지 않는다. 본 문단에서 언급된 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참고로 인용되었다. VEGF 패밀리 구성원은 주로, 수용체 티로신 키나아제에 결합함으로써 작용한다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나아제는 하나 이상의 특이적 성장 인자, 트랜스멤브레인 도메인 (일반적으로, 알파 헬릭스), 막근접 도메인 (여기서, 수용체는 예를 들어, 포스포릴화에 의해 조절될 수 있음), 티로신 키나아제 도메인 (수용체의 촉매 성분), 및 많은 수용체에서 티로신 키나아제에 대한 기질의 인식 및 결합에 관여하는 카르복시-말단 테일에 결합할 수 있는 세포외 도메인을 갖는 당단백질이다. VEGF에 결합하는 것으로 공지된 3개의 내피세포-특이적 수용체 티로신이 있다: VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR 또는 Flk-1) 및 VEGFR-3 (Flt4). Flt-1 및 KDR (또한, VEGFR-2 또는 Flk-1, 이는 본원에서 혼용되어 사용됨)는 일차 고친화도 VEGF 수용체로서 확인되었다. Flt-1은 VEGF에 대해 더 높은 친화도를 가지지만, KDR은 더 많은 내피세포 발현을 나타낸다 (Bikfalvi et al., J.Cell. Physiol., 149: 50-59 (1991)). 게다가, KDR은 혈관신생 반응을 지배하는 것으로 여겨지며, 따라서, 치료학적 및 진단학적으로 더욱 흥미롭다 (문헌 [Cohen et al. 1999, supra] 참조). KDR의 발현은 혈관신생 혈관 특히, 강한 혈관신생 반응을 유도하는 암종에서 고도로 상향조절된다 (Veikkola et al., Cancer Res., 60:203-212 (2000)). 혈관신생생성에서 KDR의 중요한 역할은 동형 KDR 넉아웃 마우스 배아에서 혈관 발생의 완전한 결여에 의해 두드러진다 (Folkman et al., Cancer Medicine, 5th Edition (B.C. Decker In.; Ontario, Canada, 2000) pp. 132-152). KDR (키나아제 도메인 영역)은 이의 성숙 형태에서 1336개의 아미노산으로 이루어진다. KDR의 글리코실화된 형태는 약 205kDa의 겉보기 분자량으로 SDS-PAGE 겔상에서 이동한다. KDR은 이의 세포외 도메인에서 7개의 면역글로불린형 도메인을 함유하며, 이의 처음 3개는 VEGF 결합에서 가장 중요하다 (Cohen et al. 1999, supra). VEGF 자체는 동시에 두개의 KDR 분자에 결합할 수 있는 호모다이머이다. 결과는 두개의 KDR 분자가 결합 및 자동포스포릴화시 다이머화되며, 더욱 더 활성화된다. 증가된 키나아제 활성은 이어서 VEGF의 KDR-특이적 생물학적 효과를 매개하는 시그널 경로를 개시한다. 이와 같이, 혈관신생생성에 중요한 생체내 KDR의 VEGF 결합 활성 뿐만 아니라, 내피세포상에서 KDR 상항조절을 검출하거나 VEGF/KDR 결합 복합물을 검출하는 능력이 혈관신생생성을 검출하거나 모니터링하는데 매우 이로울 것이다. 기체 충전된 초음파 조형제가 초음파조영술에 대해 특히 효과적인 초음파 반사경이라는 것은 널리 공지되어 있다. 이러한 초음파 조영제는 예를 들어, 기체-충전된 미세소포 예컨대, 기체-충전된 마이크로버블 및 기체 충전된 마이크로벌룬을 포함한다. 기체 충전된 마이크로버블이 특히 바람직한 초음파 조영제이다. (본 문헌에서, 용어 "마이크로버블"은 특히 포스포리피드에 의해 둘러쌓이거나 안정화된 기체 버블을 나타낸다). 예를 들어, 담체 액체중의 공기- 또는 기체-충전된 마이크로버블의 현탁물의 생체 혈류내로 주입은, 초음파 조영 이미지를 강화시켜, 내부 해부학적 구조의 가시화를 돕는다. 혈관 및 내부 기관의 이미지화는 예를 들어, 신생물 형성, 심혈관 및 기타 질환의 검출을 위한 의학적 진단을 도울 수 있다. 진단 및 치료 목적에 있어서, 목적하는 표적에 대해 높은 결합 친화도를 나타내는 표적화 벡터 조성물 (예를 들어, KDR 또는 VEGF/KDR 복합물)을 기체 충전된 초음파 조영제로 혼입시키는 것이 특히 유리할 것이다. 예를 들어, 표적화 벡터 - 포스포리피드 컨쥬게이트 및 특히, 표적화 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트는 표적화된 기체 충전된 초음파 조영제를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 고도로 정제된 형태의 이러한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 생성 방법이 특히 유리할 것이다. 이러한 조성물 및 방법은 진단학적 또는 치료학적 적용 예를 들어, 표적 부위로 리포터 부분, 종양억제제 또는 혈관신생형성 억제제를 정확히 표적화시키는데 사용하기 위한 조성물의 생성을 가능하게 할 것이다. 발명의 요약 본 발명은 기체 충전된 조영제의 제조에 유용한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트 및 특히, 표적화 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 표적화 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트는 높은 KDR 결합 친화도를 나타내는 표적화 펩티드를 포함하며, 따라서 혈관신생생성 과정의 이미지화를 위한 조영제의 유용한 성분이다. 본 발명은 또한, 기체 충전된 초음파 조영제, 및 특히, KDR를 표적화시키고 혈관신생 과정의 이미지화에 사용될 수 있는 초음파 조영제의 제조에 유용한 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (또한, 본원에서 리포펩티드로서 칭함)를 제공한다. 본 발명은 또한, 고도로 순수한 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트, 특히 높은 KDR 결합 친화도를 갖는 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 생성을 위한 방법 및 공정을 제공한다. 본 발명은 또한, 최소 수준의 트리플루오로아세트산 (TFA)을 갖는 고도로 순수한 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 생성을 위한 방법 및 공정을 제공한다. 본 발명은 또한, 고순도의 단량체 펩티드 및 다중 펩티드 서브-유닛으로부터의 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 작제물을 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 고친화도로 KDR 또는 VEGF/KDR 복합물과 결합하는 단량체 펩티드 및 이러한 단량체 펩티드를 합성하고 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트로부터 제조된 표적화된 초음파 조영제를 제공한다. 이러한 표적화된 초음파 조영제는 표적-함유 조직을 이미지화하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 표적화된 초음파 조영제는 높은 KDR 결합 친화도를 나타내는 표적화 펩티드를 포함하는 표적화된 마이크로버블 및 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트이며, 따라서, KDR-함유 조직의 이미지화 특히, 종양 및 혈관신생생성 과정의 이미지화를 위한 조영제의 유용한 성분이다. 이러한 표적화된 초음파 조영제를 제조하고 사용하는 방법이 또한 제공된다. 도면의 간단한 설명 도 1은 선형 펩티드 단량체 (2)로부터 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)의 생성 방법을 나타낸다. 도 2는 KDR에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 펩티드를 포함하는 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)를 나타낸다. 도 3은 펩티드 단량체로부터 전구체 다이머 펩티드 (16)의 생성 방법을 나타낸다. 도 4는 KDR에 대해 고친화도로 결합하는 펩티드를 함유하는 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 제조하기 위한 DSPE-PEG2000-NH2로 도 1에 도시된 전구체 다이머 펩티드를 컨쥬게이팅시키는 방법을 나타낸다. 도 5는 KDR에 고친화도로 결합하는 펩티드를 함유하는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 나타낸다. 도 6은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (예컨대, (21))의 생성 방법을 나타낸다. 도 7은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (예컨대, (21))의 또 다른 생성 방법을 나타낸다. 도 8은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트의 또 다른 생성 방법을 나타낸다. 도 9는 KDR에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 또 다른 대표적인 단량체 펩티드 (32)를 나타낸다. 도 10은 도 9에 도시된 단량체 펩티드를 포함하는 또 다른 단량체 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (31)를 나타낸다. 도 11A-C는 1) 기준선 (도 11A)에서; 2) 25분 후 (도 11B); 및 3) 기준선 및 자유로운 순환 버블을 감한 후 (도 11C)에 조영제중의 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (11) (도 52에 도시됨)를 사용함으로써 수득된 이미지를 나타낸다. 도 12A-C는 1) 기준선 (도 12A)에서; 2) 25분 후 (도 12B); 및 3) 기준선 및 자유로운 순환 버블을 감한 후 (도 12C)에 조영제중의 단량체 포스포리피드 펩티드 컨쥬게이트 (1) (도 2에 도시됨)를 사용함으로써 수득된 이미지를 나타낸다.