사포닌 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물 document_id A220623065315

개선된 면역원성을 지니는 신규한 조성물 또는 백신은 항상 요구된다. 하나의 방법으로서, 임의의 제공된 항원에 대해 발생하는 면역 반응을 시험하고 개선시키기 위해 애쥬번트를 사용하여 왔다. 지질다당류 (LPS)는 그람-음성 박테리아의 외막의 외부 소엽(leaflet)의 주요 표면 분자로, 이러한 외막의 외부 소엽에서만 발생한다. LPS는 혈청 보체 및 포식 세포에 의한 박테리아의 파괴를 방해하며, 이는 집락화를 위한 부착과 관련된다. LPS는 대략 10,000 달톤 크기의 구조적으로 관련된 복합 분자 그룹이며, 이는 세개의 공유적으로 연결된 영역으로 구성된다: (ⅰ) 외부 영역의 O-특이적 다당류 사슬 (O-항원) (ⅱ) 코어 올리고다당류 중심 영역 (ⅲ) 지질 A - 소수성 앵커 (anchor)로 작용하는 가장 내부의 영역, 이는 장쇄 지방산을 지니는 글루코사민 이당류 단위를 포함함. LPS의 생물학적 활성, 예를들어 치사 독성, 발열원성 및 애쥬번트성은 지질 A 부분과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 면역원성은 O-특이적 다당류 성분 (O-항원)과 관련이 있다. LPS 및 지질 A 둘 모두는 이들의 강력한 애쥬번트 효과에 대해 오래전부터 공지되어 왔으나, 높은 독성으로 인해 이들 분자는 백신 제형에서의 사용이 배제되어 왔다. 따라서, LPS 또는 지질 A의 애쥬번트성을 유지시키면서 이들의 독성을 감소시키려는 유의한 노력이 이루어져 왔다. 1966년에 살모넬라 미네소타 (Salmonella minnesota) 돌연변이 R595가 모 (평활주) 균주의 배양물로부터 분리되었다 (Luderitz et al. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374). 선택된 콜로니가 파아지 패널(panel)에 의한 용해에 대한 민감성이 스크리닝되고, 추가 연구 동안 협소한 범위의 민감성 (단지 하나 또는 두개의 파지에 대한 민감성)을 나타내는 콜로니 만이 선택되었다. 이러한 연구는 LPS 생합성이 결여되고, S. 미네소타 R595로 언급되는 심층의 R형 (rough) 돌연변이 균주의 분리를 이끌어 내었다. 기타 LPS와 비교하여, 돌연변이 S. 미네소타 R595에 의해 생성된 LPS는 비교적 단순한 구조를 지닌다. (ⅰ) 이들은 O-특이적 영역을 지니지 않는다 - 야생형 평활 표현형으로부터 돌연변이 R형 표현형으로 전환하여, 독성이 상실되는 것을 특징으로 한다. (ⅱ) 코어 영역이 매우 짧다 - 이러한 특징은 다양한 화학제품에 대한 균주의 민감성을 증가시킨다. (ⅲ) 지질 A 부분이 7개 이하의 지방산으로 고도로 아실화되어 있다. 그람-음성 박테리아의 심층 R형 돌연변이 균주로부터 추출된 LPS의 산 가수분해에 의해 수득될 수 있는 4'-모노포스포릴 지질 A (MPL)은 LPS의 애쥬번트 특성을 보유하면서, 독성이 1000배 이상으로 감소 (병아리 부화란에서의 치사량에 의해 측정됨)되는 것을 나타낸다 (Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516). LPS는 통상적으로 약 30분의 기간 동안 중간 강도 (예를들어, 0.1M HCl)의 광산 용액에서 환류된다. 이러한 공정은 1' 위치에서 탈인산화를 발생시키고, 6' 위치에서 데카르보히드레이션(carbohydration)을 발생시켜, MPL을 생성시킨다. MPL의 약한 알칼리성 가수분해에 의해 수득될 수 있는 3-O-데아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)는 애쥬번트성을 유지하면서 추가로 감소된 독성을 지닌다 (참고: US 4,912,094 (Ribi Immunochemicals)). 알칼리성 가수분해는 통상적으로 약한 염기, 예를들어 pH 10.5의 0.5M 탄산나트륨의 수용액으로 포화시킴으로써, 유기 용매, 예를들어 클로로포름/메탄올의 혼합물에서 수행된다. 3D-MPL의 제조에 대한 추가의 정보는 예를들어 US 4,912,094 및 WO 02/078637 (Corixa Corporation)에서 이용가능하다. 퀼라자 사포닌은 나무 퀼라자 사포나리아 (Quillaja saponaria)의 나무껍질로부터 추출된 트리테르펜 글리코시드의 혼합물이다. 미정제 사포닌이 수의용 애쥬번트로 광범위하게 사용된다. Quil-A는 퀼라자 사포닌 물질의 부분적으로 정제된 수성 추출물이다. QS21은 Quil A의 Hplc 정제된 비독성 분획이며, 이의 생성 방법은 미국 특허 제 5,057,540호에 기술 (QA21로서 기술됨)되어 있다. 예를들어, 인플루엔자 백신 및 인간 파필로마 바이러스 (HPV)에 대한 백신이 애쥬번트를 이용하여 개발되었다. 인플루엔자 바이러스는 인간 및 가축 둘 모두를 감염시키는 세계에서 가장 편재되어 있는 바이러스중 하나이다. 인플루엔자는 유의한 경제적 부담, 사망율 및 치사율을 발생시킨다. 인플루엔자 바이러스는 약 125 nm 직경의 입자 크기를 지니는 RNA 피막 바이러스이다. 이는 기본적으로 지질 이중층 구조 및 표면 당단백질을 지닌 바이러스 외피에 의해 둘러싸인 내부 누클레오캡시드 또는 핵 단백질과 결합된 리보핵산 (RNA)의 코어로 구성된다. 바이러스 외피의 내층은 주로 기질 단백질로 구성되고, 외층은 대부분이 숙주에서 유래된 지질 물질이다. 인플루엔자 바이러스는 입자의 표면에 10 내지 12 nm 길이의 스파이크로서 보여지는 두개의 표면 항원인 당단백질 뉴라미니다아제 (NA) 및 헤마글루티닌 (HA)을 포함한다. 이러한 표면 항원, 특히 헤마글루티닌이 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정한다. 이러한 표면 항원은 점진적으로, 때로는 신속하게 인플루엔자에서 항원성 변이를 발생시키는 약간의 변화를 겪는다. '드리프트(drift)' 및 '시프트(shift)'으로 언급되는 이러한 항원성 변화는 예측불가능하며, 바이러스가 면역계로부터 회피하는 것을 가능케 하여 결국에는 거의 매년 널리 공지된 전염병을 야기시키는 새로운 인플루엔자 균주의 출현을 발생시킨다는 관점에서 면역학적으로 극적인 영향력을 지닐 수 있다. 각각의 시즌에 인플루엔자 백신으로 포함되는 인플루엔자 바이러스 균주는 세계 보건기구와 국가 보건당국 및 백신 제조업체의 협력에 의해 결정된다. HA는 다양한 인플루엔자 균주의 혈청학적 특이성을 규정하는데 있어서 매우 중요한 항원이다. 이러한 75-80kD의 단백질은 다수의 항원결정기를 함유하며, 이중 여러 항원결정기는 다양한 균주에서 서열 변화를 겪은 영역 (균주-특이적 결정기)에 존재하고, 나머지는 다수의 HA 분자에 대해 통상적인 영역 (결정기에 대해 통상적)에 존재한다. 인플루엔자 바이러스는 거의 매 겨울에 전염병을 야기시키고, 타입 A 또는 B 바이러스에 대한 감염 속도는 6주 기간에 걸쳐 40% 만큼 높다. 인플루엔자 감염은 경증의 상기도 감염을 통한 준임상적 감염으로부터 여러 바이러스성 폐렴까지 다양한 질병 상태를 발생시킨다. 통상적인 인플루엔자 전염병은 폐렴 및 하기도 질병의 발생을 증가시키고, 이는 입원 또는 사망률의 증가에 의해 입증된다. 질병의 중증도는 주로 환자의 연령, 환자의 면역 상태 및 감염 부위에 의해 결정된다. 65세 및 이를 초과하는 중년의 인간이 특히 공격받기 쉬우며, 개발도상국에서 모든 인플루엔자 관련 사망의 80-90%를 차지한다. 만성 질병에 걸려 있는 개체가 또한 상기 합병증을 겪을 가능성이 높다. 매우 어린 유아가 또한 중증 빌병으로부터 고통 받을 수 있다. 따라서, 특히 이러한 그룹이 보호될 필요가 있다. 이러한 '위험' 그룹 이외에, 보건 당국은 또한 중년의 인간과 접촉하는 건강한 성인에게도 또한 예방접종을 권고한다. 예방접종은 매년의 인플루엔자 전염병을 제어하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 현재 이용가능한 인플루엔자 백신은 불활성화되거나 살아있는 약독된 인플루엔자 백신이다. 불활성화된 인플루엔자 백신은 세개의 가능한 형태의 항원성 제조물로 구성된다: 불활성화된 전체 바이러스, 정제된 바이러스 입자가 세제 또는 지질 외피를 용해시키는 기타 시약으로 파열된 서브-비리온 (소위 "스플릿(split)" 백신) 또는 정제된 HA 및 NA (서브유닛 백신). 이들 불활성화된 백신은 근내 (i.m.) 또는 비내 (i.n.) 투여된다. 모든 종류의 인플루엔자 백신은 보통 3가 백신이다. 이들은 일반적으로 두개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 균주로부터 유래된 항원을 함유한다. 대부분의 경우 표준 0.5 ml 주사 투여량은 단일원면역확산법 (SRD)으로 측정시, 15 ㎍의 각각의 균주로부터의 헤마글루티닌 항원 성분을 함유한다 (J. M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). 현재 이용가능한 인플루엔자 백신은 모든 연령의 그룹에 안전한 것으로 여겨진다 (De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). 그러나, 현재의 인플루엔자 백신이 2세 미만의 연령의 유아에 효과가 있다는 증거가 거의 없다. 더욱이, 통상적으로 확인된 인플루엔자 질병의 예방에 대해 보고된 백신 효능의 비율은 중년에 대해서는 23-72%로, 이는 보다 젊은 성인에 대해 보고된 60-90%의 효능 비보다 현저하게 낮다 (Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc, 21 , 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527). 인플루엔자 백신의 효과는 바이러스 균주에 대한 적혈구응집 억제 (HI) 항체의 혈청 역가와 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌고, 여러 연구는 보다 나이든 성인이 보다 젊은 성인보다 인플루엔자 면역화 후에 낮은 HI 역가를 나타내는 것을 발견하였다 (Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427- 439). 따라서, 개선된 면역원성을 지니는 새로운 백신이 여전히 요구된다. 효능있는 애쥬번트를 지니는 백신 항원의 제형이 서브비리온 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 데에 가능한 방법이다. 수중유 에멀젼 형태의 애쥬번트 MF59로 애쥬번팅된 서브-유닛 인플루엔자 백신이 시판되고 있으며, 애쥬번팅되지 않은 서브-유닛 백신으로 수득되는 것보다 높은 항체 역가를 발생시키는 능력이 입증되었다 (De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). 그러나, 이후의 출원에서, 동일한 백신은 애쥬번팅되지 않은 스플릿 백신에 비해 개선된 프로파일을 입증하지 못했다 (Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289). 배경 지식으로서, 대유행기 기간 동안, 인플루엔자 바이러스는 이전의 유행병으로부터의 인플루엔자 바이러스와 관련되어 순환된다. 바이러스는 다양한 수준의 생애 초기의 감염으로부터의 면역성을 지닌 인간들 사이에 확산된다. 보통 2-3년의 주기에 걸친 이러한 순환은 일반 집단에 대해 전염병을 야기시키기에 충분하게 변화된 새로운 균주의 선택을 촉진하며; 이러한 과정을 '항원성 드리프트 (antigenic drift)'로 칭한다. '드리프트 변이체'는 임의의 1년 동안 다양한 사회, 영역, 국가 또는 대륙에서 다양한 영향을 미칠 수 있으나, 여러 해에 걸친 이들의 종합적인 영향은 종종 유사하다. 즉, 인간 집단이 면역원성을 지니지 않는 새로운 인플루엔자 바이러스가 출현하는 경우 인플루엔자 전염병이 발생한다. 통상적인 인플루엔자 전염병은 입원 또는 사망률 비의 증가에 의해 입증되는 바와 같이 폐렴 및 하기도 질병의 발병률을 증가시킨다. 중년 또는 만성 질병을 지닌 인간은 상기 합병증을 경험할 가능성이 크나, 어린 유아 또한 중증 질병에 걸릴 수 있다. 예측불가능한 간격으로, 전염병 시즌 전에 순환하는 균주로부터 전체적으로 다양한 서브타입의 핵심 표면 항원인 헤마글루티닌을 지니는 새로운 인플루엔자 바이러스가 출현한다. 여기서, 생성된 항원은 이전에 인간에서 순환하는 균주의 상응하는 단백질과 20% 내지 50% 만큼 변화할 수 있다. 이는 '집단 면역'을 회피하여 범유행병을 발생시키는 바이러스를 생성시킬 수 있다. 이러한 현상을 '항원성 시프트 (antigenic shift)'로 칭한다. 적어도 종래에는 상이한 종으로부터의 인플루엔자 바이러스, 예를들어 조류 또는 돼지 인플루엔자 바이러스가 종간 장벽을 가로지르는 경우 범유행병이 발생하는 것으로 생각되었다. 이러한 바이러스가 인간 대 인간으로 확산될 잠재력을 지니는 경우, 이러한 바이러스는 수개월 내지 1년 내에 세계적으로 확산되어, 범유행병을 발생시킬 수 있다. 예를들어, 1957년 (아시아 독감 범유행병)에는 H2N2 서브타입의 바이러스가, 바이러스가 최초로 분리된 적어도 1918년 이래로 인간 집단에서 순환된 H1N1 바이러스를 대체하였다. H2 HA 및 N2 NA는, HA가 H3N2 인플루엔자 서브타입의 출현에 의해 1968년 (홍콩 독감 범유행병)에 대체된 1957 내지 1968년 사이에 항원성 드리프트를 겪었고, 이후 N2 NA는 H3 HA와 함께 드리프트를 지속하였다 (Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395). 범유행병 창궐을 야기시키는 잠재력을 제공하는 인플루엔자 바이러스 균주의 특징은, 뉴라미니다아제 서브타입의 변화를 동반하거나 동반하지 않은, 현재 순환하는 균주의 헤마글루티닌에 비해 새로운 헤마글루티닌을 함유하며; 인간 집단에서 수평적으로 전염될 수 있으며; 인간에 대해 병원성이라는 점이다. 새로운 헤마글루티닌은 H2와 같이 연장된 기간, 아마 수십년 동안 인간 집단에서 밝혀지지 않은 것일 수 있다. 또는, 이는 조류에서 발견된 H5, H9, H7 또는 H6과 같이 이전에 인간 집단에서 순환하지 않은 헤마글루티닌일 수 있다. 대부분의 집단, 또는 적어도 많은 비율의 집단, 또는 전체 집단이 이전에 항원을 조우하지 않은 경우, 이러한 항원에 대해 면역학적으로 나이브(naive)하게 된다. 파필로마바이러스는 매우 종 특이적인 작은 DNA 종양 바이러스이다. 지금까지, 100개가 넘는 개별적인 인간 파필로마바이러스 (HPV) 유전형이 기술되었다. HPV는 일반적으로 피부 (예를들어, HPV-1 및 -2) 또는 점막 표면 (예를들어, HPV-6 및 -11)에 대해 특이적이고, 보통 수개월 또는 수년 동안 지속되는 양성 종양 (사마귀)를 발생시킨다. 이러한 양성 종양은 관련된 개체를 괴롭힐 수는 있으나, 몇몇 예외를 제외하고는 생명을 위협하지는 않는다. 몇몇 HPV는 또한 암과 관련된다. HPV와 인간 암 사이의 가장 확실한 관련성은 HPV-16 및 HPV-18과 자궁경부암종 사이에 존재한다. 자궁경부암은 개발 도상국에서 가장 흔한 악성 종양으로, 매년 전세계에서 약 500,000명의 새로운 환자가 발생한다. 현재 백신을 이용하여 원발성 HPV-16 감염, 및 확립된 HPV-16-함유 암을 실효적으로 치료하는 것이 기술적으로 가능하다. HPV-16에 대한 예방적 및 치료적 예방접종에 관한 개관을 위해서는 문헌[Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1 (4) 293-306 and Hagenesee M. E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556,559-564]을 참조하라. 약간의 변이가 발생하나, 기술된 모든 HPV 유전체는 적어도 8개의 조기 유전자인 E1 내지 E8 및 두개의 후기 유전자인 L1 및 L2를 지닌다. 또한, 업스트림 조절 영역은 HPV 유전체의 전사를 가장 제어하는 것으로 보이는 조절 서열을 지닌다. HPV L1 기재 백신은 WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 및 WO 94/05792에 기술되어 있다. 이러한 백신은 모노머, 캡소머 또는 바이러스 유사 입자로서 L1 항원을 포함할 수 있다. VLP의 제조 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 예를들어 WO9913056 및 US6245568에 기술되어 있는 바와 같이 향상된 균질성을 제공하는 VLP 디스어셈블리(disassembly)-리어셈블리(reassembly) 방법을 포함한다. 이러한 입자는 추가로 L2 단백질을 포함한다. L2 기재 백신은 예를들어 WO93/00436에 기술되어 있다. 기타 HPV 백신 방법은 E7와 같은 조기 단백질 또는 L2-E7과 같은 융합 단백질을 기재로 한다. 중년 집단에 대한 인플루엔자, 특히 인플루엔자 범유행병의 경우, 또는 HPV 백신의 경우 개선된 백신이 여전히 요구된다. 지질다당류 및 퀼라자 사포닌의 조합물을 함유하는 애쥬번트가 예를들어 EP 0671948에서와 같이 종래에 기술되어 있다. 이러한 특허는 지질다당류 (3D-MPL)가 퀼라자 사포닌 (QS21)과 조합되는 경우의 강한 상승작용을 입증한다. 본 발명에서는 인간 투여량에서 면역자극제가 낮은 양으로 존재하는 경우에서도 애쥬번트 조성물 내의 면역자극제로서 지질다당류 및 퀼라자 사포닌의 조합물을 이용하여 우수한 애쥬번트 특성이 달성될 수 있음을 발견하였다.