시료의 다중 분석 document_id A220623065397

하기의 기술은 본 발명에 관련된 정보의 개요를 제공하며, 본원에 제공된 임의의 정보 또는 언급된 간행물들은 본 발명에 현재 청구된 것에 대한 종래기술일 뿐 특허에 관한 것은 아니다. 생물학적 샘플들 및 다른 샘플들에서 생리학적으로 중요한 분자들의 검출 및 정량을 유도하는 검정법(assay)은 과학적 연구 및 건강관리 분야에서의 중요한 수단이다. 이러한 검정법의 종류 중 하나는 고체 지지체상에 고정된 하나 또는 그 이상의 압타머(aptamers)를 포함하는 마이크로어레이(microarray)의 이용을 포함한다. 상기 압타머들은 각각 매우 특이적인 방식과 매우 높은 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제5,475,096호("Nucleic Acid Ligands") 참조. 또한, 미국 특허등록번호 제6,242,246호, 미국 특허등록번호 제6,458,543호 및 미국 특허등록번호 제6,503,715호(각각 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip") 참조. 일단 마이크로어레이가 샘플과 접촉하면, 압타머들은 샘플 내에 존재하는 각각의 표적 분자들에 결합하고, 그것에 의하여 샘플 내 표적 분자들의 부재, 존재, 양 및/또는 농도를 측정할 수 있다. 이 검정법의 변종은 압타머들이 표적 분자들에 공유적으로 결합하거나 광교차결합(photocrosslink)을 할 수 있게 하는 광반응성 작용기를 포함하는 압타머들을 사용한다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제6,544,776호("Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip") 참조. 이러한 광반응성 압타머들은 또한 광압타머(photoaptamers)라고도 칭해진다. 예를 들어, 미국 특허등록번호 제5,763,177호, 미국 특허등록번호 제6,001,577호 및 미국 특허등록번호 제6,291,184호(각각 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX") 참조. 또한, 미국 특허등록번호 제6,458,539호("Photoselection of Nucleic Acid Ligands") 참조. 마이크로어레이를 샘플과 접촉시킨 후 광압타머들은 표적 분자들에 결합할 기회를 가지게 되고, 상기 광압타머들은 광활성화되며, 임의의 비특이적으로 결합한 분자들을 제거하기 위하여 고체 지지체는 세척하였다. 광압타머 상의 광활성화된 작용기들에 영향을 받은 공유결합 때문에, 광압타머들에 결합된 표적 분자들은 일반적으로 잘 제거되지 않으므로 엄격한 세척 조건이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 검정법은 시료 내 표적 분자들의 부재, 존재, 양 및/또는 농도를 측정할 수 있다. 이러한 검정법의 형식들 모두에서, 압타머들은 샘플과 접촉되기 전에 고체 지지체 상에 고정된다. 그러나 어떤 환경 하에서는, 샘플과 접촉하기 전의 압타머의 고정화는 최적의 검정을 제공하지 않을 수 있다. 예를 들어, 압타머의 전고정화(pre-immobilization)는 고체 지지체의 표면상에서 표적 분자들과 압타머들의 비효율적 혼합을 야기할 수 있으며, 아마도 반응시간이 길어지게 되므로 표적 분자들에 압타머들이 효율적으로 결합할 수 있도록 배양 기간이 늘어나게 된다. 게다가, 광압타머들이 검정법에 사용되고 고체 지지체로서 사용된 물질에 좌우되는 경우, 상기 고체 지지체는 광압타머와 표적 분자들간의 공유결합 형성에 영향을 주기 위하여 사용된 빛을 산란시키거나 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 더욱이, 사용된 방법에 의존하는 압타머에 결합된 표적 분자들의 검출은 고체 지지체의 표면이 또한 사용된 임의의 표지 시약에 노출될 수 있고 영향을 받을 수 있기 때문에 부정확해질 수 있다. 결론적으로, 고체 지지체 상의 압타머의 고정화는 일반적으로 샘플에 압타머를 노출시키기 전 압타머-준비 단계(aptamer-preparation step; 즉, 고정화)를 포함하며, 이 준비 단계는 압타머의 활성 또는 기능성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, (1) 압타머의 활성, (2) 압타머-표적 분자 복합체에 대한 결합 평형상태 달성의 효율, (3) 압타머와 표적 분자간의 공유결합 형성 및 (4) 압타머-표적 분자 복합체의 검출에 영향을 주는 조건을 최적화시킴으로써, 시료 내 표적 분자들의 검출 및/또는 정량을 위한 높은 민감도의 검정법을 제공하는 방법, 기구, 시약 및 키트가 필요하다. 본 명세서는 시료에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 표적 분자들의 검출 및/또는 정량을 위한 방법, 기구, 시약 및 키트를 포함한다. 한 실시예에서, 시료는 태그(tag)를 포함하고 표적 분자에 대하여 특이적인 친화력을 가지는 압타머와 접촉된다. 표적 분자에 결합된 압타머를 포함하는 압타머 친화 복합체(aptamer affinity complex)가 형성된다. 만일 시료가 표적 분자를 함유하고 있다면, 압타머 친화 복합체는 일반적으로 시료 내에서 형성될 것이다. 압타머 친화 복합체는 표적 분자와 공유적으로 결합된 압타머를 포함하는 압타머 공유결합 복합체(aptamer covalent complex)로 선택적으로 전환된다. 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 그 후 고체 지지체를 사용하고, 질량 분석법을 사용하고 정량 중합효소 연쇄반응법(quantitative polymerase chain reaction; Q-PCR)을 사용하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 당업자에게 잘 알려져 있는 임의의 다양한 방법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 한 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 고체 지지체의 사용을 통하여 검출되고/되거나 정량화된다. 이 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 고체 지지체에 부착된다. 상기 부착은 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)와 고체 지지체를 접촉시키고, 고체 지지체에 부착된 프로브와 직접 또는 간접적으로 결합시키기 위하여 압타머 상에 포함된 태그와 접촉하게 함으로써 달성된다. 고체 지지체 상에 프로브와 결합된 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 그 후 검출되고 선택적으로 정량화된다. 검출 및 선택적 정량 전의 어떤 시점, 즉 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)가 고체 지지체에 부착되기 전 또는 후라면 언제라도 상기 복합체는 결합된 표적 분자의 검출을 가능하게 하기 위한 표지 시약과 접촉된다. 또 다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 선택적 공유결합 복합체)는 질량 분석법을 사용하여 검출되고/되거나 정량화된다. 이 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 선택적 공유결합 복합체)는 압타머 친화 복합체(또는 선택적 공유결합 복합체)를 고체 지지체와 접촉시키고, 압타머 상에 포함된 태그가 직접 또는 간접적으로 고체 지지체에 부착되는 프로브와 접촉하게 함으로써 고체 지지체에 부착된다. 이는 시료의 잔여물로부터 압타머 친화 복합체(또는 선택적 공유결합 복합체)의 분리(partitioning)를 용이하게 하므로, 그것에 의해 질량 분석계 분석 전에 표적 분자를 농축하고, 이 분석 수단을 사용하여 복합체 혼합물로부터 분석체의 검출 및 정량화를 향상시키는데 용이하다. 고체 지지체 상의 프로브와 결합된 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공융결합 복합체)는 그 후 용리되고, 표적 분자를 확인하기 위하여 사용될 수 있는 피크의 스펙트럼을 만드는 질량 분석계를 사용하여 분석되고 검출된다. 일단 표적 분자가 검출되면, 선택적으로 그것은 또한 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 기술에 의해 정량화될 수 있다. 한 실시예에서 표적 분자가 단백질인 경우, 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)를 분석하기 위하여 질량 분석계를 사용하기 전, 표적 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있는 결합 표적 분자의 분획을 생산하기 위해 예를 들어, 프로테이나아제 K(proteinase K) 또는 트립신과 같은 프로테아제 효소를 사용하여 절단될 수 있고, 그것에 의해 표적 분자의 검출 및 선택적 정량이 가능하다. 또 다른 실시예에서, 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 Q-PCR을 사용하여 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 이 실시예에서, 시료 내의 자유 압타머(free aptamer)는 검출 및/또는 정량 전에 압타머 친화 복합체(또는 압타머 공유결합 복합체)로부터 분리된다. 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)는 PCR을 수행하고, 시료 내의 표적 분자와 결합한 압타머의 양 또는 농도를 직접 또는 간접적으로 측정함으로써 정량화된다. 시료 내 표적 분자의 양 또는 농도는 일반적으로 Q-PCR을 사용하여 정량화된 압타머의 양 또는 농도에 대하여 정비례한다. 이 방법에서 압타머 친화 복합체(또는 선택적 압타머 공유결합 복합체)를 정량하기 위해 사용될 수 있는 대표적인 방법은 TaqMan® 검정법(PE Biosystems, Foster City, Calif.; 또한 U.S. Pat. No. 5,210,015 참조)이다.