동결된 제대조직으로부터 유래하는 생존가능한 세포 document_id A220623065449

UC는 추후의 장배형성 (3개의 배아 배엽층의 형성)을 구성하는 제1 구조 중 하나이다. 폴딩 (folding)이 시작됨에 따라서, 배아 원반은 다시 제대 혈관를 형성하도록 발생하는 난황 및 요막 혈관을 통해 원시 중간장관 (배아 기원)에 의해 원시 난황난 (외부-배아 기원)에 결합된다 [Haynesworth et al., 1998; Pereda and Motta, 2002; Tuchmann-Duplessis et al., 1972]. 이들 혈관은 워튼 젤리 (WJ; Wharton's Jelly)라 불리는 최초 외부-배아 유도의 원시 중간엽 조직으로 일반적으로 고려되는 것 내에 지지되고, 그에 의해 둘러싸인다 [Weiss, 1983]. 이 초기 단계로부터, UC는 임신 중에 성장하여 출생때 보여지는 30-50 cm 제대가 된다. 따라서, WJ는 섬유모세포-유사, 또는 문헌 (하기 참조)에 기재된 근육-섬유모세포-유사 세포뿐만 아니라 배아 및 태아 발생 동안 제대의 성장을 지지하기 위해 필요한 WJ의 확장 부피의 세포를 유발할 수 있는 전구세포의 군집을 함유한다는 것이 예상될 수 있다. WJ는 그의 논문 아데노그라피아 [Adenographia in 1656]에 공개한 토마스 워튼 (Thomas Wharton)에 의해 처음 기재되었다. 그 후에, 이것은 히알루론산 [Schoenberg et al., 1960]을 비롯한 프로테오글리칸, 및 다양한 유형의 콜라겐 [Nanaev et al., 1997]으로 이루어진 무정형 기저 물질에 분산된 세포로 구성된 젤라틴성의 느슨한 점액질 결합조직으로서 정의되었다. 매트릭스에 분산된 세포는 붕괴된 제대의 모양에서 방사상이고, 팽창한 제대에서는 길게 늘어나는 "섬유모세포-유사"로서 기재되어 있다 [Parry, 1970]. 평활근 세포는 초기에 매트릭스 내에서 관찰되었지만 [Chacko and Reynolds, 1954], 이는 이들을 외면상으로 평활근 세포를 닮은 다소 "비정상인 섬유모세포"로서 기재한 파리 [Parry, 1970]에 의해 이의가 제기되었다. 그 후에, 타케치 등 [Takechi et al., 1993]이 이들 세포 상에서 면역조직화학 조사를 수행한 1993년까지 이들 세포를 특정화하는 작업은 거의 없었다. 이들은 세포를 "무정형 기저 물질에서의 콜라겐 섬유의 장기간 세포질 프로세스 및 파형 네트워크를 갖는 "방추형 또는 방사형"인 "섬유모세포-유사"로 기재하였다 [Takechi et al., 1993]. 면역조직화학 염색을 위해서, 이들은 어떤 유형의 미오신이 WJ 섬유모세포와 결합하는지를 측정하기 위해 액틴 및 미오신 (세포질 수축성 단백질), 비멘틴 (배아 중간엽 기원의 섬유모세포의 특징) 및 데스민 (근원성 기원의 세포에 특이적임)에 대한 1차 항체를 사용하였다. 이들은 높은 수준의 화학적으로 추출가능한 액토미오신을 관찰하였으며; 비록 섬유모세포는 세포질 액토미오신을 함유하지만, 이들은 액틴 또는 미오신에 대해 염색되지 않은 반면, WJ 섬유모세포는 둘 다에 대해 양성으로 염색되었다. 또한, 비멘틴 및 데스민 둘 다에 대한 양성 염색이 관찰되었으며, 이는 WJ 중의 이들 변형된 섬유모세포가 원시 중간엽 조직으로부터 유도되었다는 결론을 유도하였다 [Takechi et al., 1993]. 그 후의 더 최근 연구 [Nanaev et al. (1997)]는 조산된 제대에서 증식성 중간엽 전구세포 분화의 5 단계를 입증하였다. 이들의 발견은 근섬유모세포가 WJ 매트릭스 내에 존재한다는 제안을 지지하였다. WJ 세포의 면역조직화학적 특징은 골 형태발성에서 골원성 세포의 주요 공급원으로 공지되고, 또한 배양액에서 콜로니 형성 단위-골모세포 (CFU-O) [Aubin, 1998]로서 불리는 골 결절을 형성할 수도 있는 혈관주위세포의 특징과 두드러진 유사성을 나타낸다 [Canfield et al., 2000]. 최근 공개문헌에는 UC 혈액보다는 UC로부터 세포를 수확하는 방법이 보고되어 있다. 미첼 등 [Mitchell et al., 2003]은 제대 혈관을 먼저 절단하여 제거하고 잔존 조직을 수확하는 방법을 기술하고 있다. 잔존 WJ (제대 혈관이 WJ 내에 완전히 둘러싸여 있기 때문에, 이들 중 일부는 혈관과 함께 제거된다) 및 양막 상피 둘 다를 포함할 잔존 조직은 이어서 주사위꼴로 절단하여 소조직 단편을 생산하고, 이것을 조직 배양 플레이트에 옮긴다. 이들 조직 단편은 이어서 1차 이식편으로 사용되며, 이것으로부터 세포가 배양 하층 상으로 이동한다. 또 다른 공개문헌에서, 로마노브 등 [Romanov et al., 2003]은 이들이 중간엽 줄기세포-유사 세포를 제대 혈관계로부터 단리하는 데 성공적이었다는 것을 시사하고 있지만, 이들은 또한 그의 배양액이 WJ로부터 유래하는 세포를 함유하지 않았음을 시사하고 있다. 구체적으로는, 이들은 혈관 내피 및 내피하 세포의 혼합 군집을 수득하는 제대 정맥 내로부터의 단일 15 분 콜라게나제 분해 (digestion)를 사용한다. 로마노브 등은 희박한 수의 섬유모세포-유사 세포가 7일 후에 이 세포 수확물로부터 나타난다는 것을 보여주었다. 또한, 미국 특허 제5,919,702호에는 인간 UC의 WJ로부터 "전-연골세포"를 단리하는 방법, 및 연골을 생산하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 특히, 상기 방법은 제대의 1인치 절편을 세로로 슬라이스하여 개방하고, 혈관 및 '케이싱 (casing)' (이들은 후에 제거된다)을 절개하고, WJ를 멸균 용기 내에 수집하고, 여기에서 WJ를 배양을 위해 2-3 ㎣ 절편으로 절단하는 단계를 포함한다. 바람직한 방법에서, 세포는 WJ의 2-3 ㎣ 절편을 페트리 디쉬의 바닥에 있는 유리 슬라이드 상에 놓고, 이것을 또 다른 슬라이드로 덮고, 이것을 '전-연골세포'가 배양 디쉬 표면으로 이동하도록 하기 위해 10-12일 동안 배양함으로써 단리된다. 2005년 7월 7일에 공개된 미국특허출원 제US2005/0148074호에서 데이비스 (Davies) 등은 혈관주위 부분이라 불리는 워튼 젤리의 특유한 부분으로부터 유래하는 독특한 전구세포 군집의 단리를 기술하였다. 이 부분에서 워튼 젤리는 제대 혈관의 외벽 상에 존재하거나, 이 외벽에 결합되며, 이들을 제대로부터 절제하는 경우에 혈관과 결합된 상태로 남는다. 전구세포 군집은 현저하게 짧은 배가시간을 가지며, 다능성이며 지방, 골, 연골, 근육 및 내피를 포함하는 다양한 중간엽 조직을 발생시키는 세포; 자발적으로 골-형성 골모세포로 분화하는 세포; 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II 마커가 결여된 세포를 포함하는, 광범한 유용한 특성을 갖는 전구세포를 포함한다. 따라서, 제대조직은 조직공학 및 그 밖의 다른 의료과정에서의 사용을 위한 전구세포 및 그 밖의 다른 세포의 중요한 공급원이 될 수 있다. 현재의 관례는 극저온 상태하에 제대-유도된 세포의 장기간 저장, 및 이들로부터 생존가능한 세포의 회수를 허용한다. 그러나, 제대세포 그 자체와는 완전히 다른 동결 또는 극저온으로 저장된 제대조직으로부터 생존가능한 세포의 회수를 허용하는 기술은 아직 개발되지 않았다. 따라서, 제대조직으로부터 생존가능한 세포의 회수가 필요한 경우에, 원하는 조직을 추출할 수 있고, 원하는 세포를 이들 세포가 여전히 생존가능하면서 단리, 배양 및 동결 저장될 수 있게 하기 위하여 기술자들은 제대조직을 그것이 신선할 동안에, 통상적으로 제대를 추출한 후 24시간 이내에 처리하도록 신속히 행동하는 것이 필요하다. 003c#발명의 요약003e# 본 발명에 이르러, 생존가능한 세포가 동결된 제대조직으로부터 회수될 수 있음이 결정되었다. 따라서, 본 발명은 동결된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수요에 따라 (on-demand) 추출하기 위한 지속적인 공급원을 제공하기 위한 산후를 기초로 하여 이러한 조직을 극저온 상태에서 "뱅킹 (banking)"하는 방법을 계획한다. 더욱 특히, 이러한 관점 중의 하나에 따르면, 본 발명은 산후에 제대조직을 수득하고, 산후 제대조직을 동결시키는 단계를 포함한다. 바람직한 관점에서, 본 발명은 생존가능한 세포를 포함하는 제대조직을 수득하고, 제대조직을 혈청-함유 세포배양 배지를 포함하는 동결보존용액 (cryopreserving solution)과 조합하고, 조합물을 일차로 동결보존제(cryopreservant)가 조직에 침투하도록 허용하는 온도에서 일정한 기간 동안 액체로서 냉동시키는 동결과정에 이 조합물을 적용시키고, 냉각된 조합물을 동결시킨 다음에 동결된 조합물을 극저온 상태하에 저장하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제대조직 내에 존재하는 세포의 생존력을 보존하기 위해서 적용된다. 이러한 관점들 중의 또 다른 것에 따르면, 본 발명은 제대조직을 동결된 형태로 수득하고, 동결된 조직을 해동시키고, 해동된 조직으로부터 생존가능한 세포를 추출하는 단계를 포함하여, 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 바람직한 관점에서, 본 발명은 특히 본 발명의 방법에 의해서 동결되고, 임의로 극저온 상태로 저장된 제대조직을 수득하고, 동결된 조직을 해동시키고, 해동된 조직을 세척하여 동결보존제를 제거하고, 생성된 조직으로부터 생존가능한 세포를 추출하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 회수하기 위해서 적용된다. 따라서, 이러한 관점들 중의 또 다른 것에서 본 발명은 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하는 방법을 제공하는데, 여기에서 세포는 미리 동결된 제대조직으로부터 추출된다. 추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 제조된 경우에는 언제나 생존가능한 상태로 회수될 수 있는 전구세포를 포함하는 동결된 상태, 및 임의로 극저온으로 보존된 상태의 제대조직을 제공한다. 본 발명의 관련된 관점에서는, 각각 상기 동결된 제대조직의 샘플을 포함하는 다수의 용기, 및 각각의 용기의 내용물에 대한 참고용 카탈로그를 포함하는 조직은행의 형태로 제대조직이 제공된다. 특정의 구체예에서, 용기는 극저온 저장에 적합한 용기이다. 추가의 관점에서, 본 발명은 미리 동결된 제대조직으로부터 생존가능한 세포를 수득하고, 이들 생존가능한 세포들 가운데에서 전구세포인 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정의 관점에서, 전구세포는 HUCPVCs이며, 본 발명은 1) a) 제대조직을 수득하고, b) 제대조직을 혈청-함유 세포배양 배지 및 DMSO를 포함하는 동결보존용액과 조합하고, c) 조합물을 DMSO가 조직에 침투하도록 허용하는 온도에서 일정 기간 동안 액체로서 냉동시키는 냉각과정에 적용하고, d) 냉각된 조합물을 동결시켜 동결된 제대조직을 제공하고, 임의로 e) 동결된 제대조직을 일정 시간 동안 극저온 상태하에 저장하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된, 임의로 극저온 상태로 저장된 제대조직인 동결된 제대조직을 수득하고 (여기에서, 제대조직은 결합된 혈관주위 워튼 젤리를 가지는 신선하게 단리된 인간 제대 혈관 또는 그의 분절이다); 2) 동결된 제대조직을 해동시키고; 3) 해동된 제대조직을 처리하여 DMSO를 물로 치환시키고; 4) 저장된 혈관과 결합된 워튼 젤리를 분해시켜 생존가능한 HUCPVCs를 방출시키는 단계를 포함하여, 동결된 제대조직으로부터 생존가능한 HUCPVCs를 회수하는 방법을 제공한다. 본 발명의 관점들은 첨부된 도면을 참조하여 이하에 더 상세하게 기술된다: