의료용 제품에서 비-내독소 발열성 오염물을 보다 잘검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험 document_id A220623065469

특정의 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물이 인간 또는 다른 포유동물의 순환계와 접촉하게 되는 경우, 이는 염증 반응 또는 염증으로 알려져 있는 전신 반응을 일으킨다. 염증 반응은 감염 및/또는 손상으로부터 신체를 보호하는 방어 기전이며; 염증은 감염 또는 손상 부위로 혈류량을 증가시킴으로써 치유 과정에 도움이 되는 필요한 체액, 단백질, 및 백혈구(white blood cell)(백혈구(leukocytes))를 가져온다. 예를 들면, 염증 반응과 관련된 한가지 증상은 체온 증가 또는 열이며, 이는 과열을 유발하는 병원체에 대한 방어 기전으로서의 작용을 한다. 염증 반응은 열, 오한, 피로감, 두통, 식욕 감퇴, 및 근육 경직을 비롯한, 각종 "독감-유사" 증상과 관련될 수 있다. 열을 일으키는 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물은 상기 화합물이 유발할 수 있는 열 반응을 지칭하면서, 역사적으로 "발열 물질" 또는 "발열성" 화합물로서 언급되어 왔다. 그러한, 몇몇 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물은 일반적으로 전염증성이고, 그들이 유발하는 염증 반응의 일부로서 열을 유발할 수 있거나, 유발하지 않을 수 있다. 일부 경우, 개개의 감수성, 및 개개에 노출되는 발열 물질의 유형 및 농도에 따라 개개는 발열 물질에 노출된 이후 생명을 위협하는 쇼크-유사 증상을 발생시킬 수 있다. 흡입될 수 있거나, 주사될 수 있거나, 또는 주입될 수 있는 의료용 제품, 및 의료용 장치, 예로서, 막 또는 이식용 물질이 특정의 발열성 위험을 내포하고 있다. 의료용 제품 및 영양제에 함유되어 있는 발열 물질을 외인성 발열 물질로 지칭하고; 반대로, 내인성 발열 물질은 외인성 발열 물질에 대한 개개의 염증 반응을 매개하는 면역계의 메신저 화합물이다. 제품 그 자체 또는 제품 생산의 부산물의 발열 성질 이외에도, 제품의 오염이 종종 발열성을 유발할 수 있다. 제품 오염에 기인한 발열성은 세균, 바이러스, 진균으로부터 유래된 발열 물질이나, 심지어는 숙주로부터 유래된 발열 물질과 같은 다양한 발열 물질 군들중 어느 하나에 의해 유발될 수 있다. 이러한 문제는 제품이 열 또는 화학적 방법에 의해 "멸균처리된" 경우에도 지속될 수 있다; 보편적으로 조우하게 되는 발열성 화합물인 세균 내독소 (대개 그램-음성 세균의 세포벽으로부터 유래된 지질다당류(LPS)로 구성됨)는 세균이 사멸된 이후에도 남아있을 수 있다. 따라서, 그러한 제품의 안전성을 확실하게 하기 위해서는 다양한 약제, 영양제, 및 비경구적으로 적용되는 의료용 제품의 발열 물질에 관해 시험하여야 한다. 보통, 발열 물질로서 작용하는 화합물은 조직, 세포, 또는 체액과 접촉한 후 단핵구에서 프로스타글란딘 및 전염증성 사이토카인과 같은 내인성 발열 물질의 생산을 자극시킴으로써 발열 물질로서 작용한다. 이것이 병에 걸린 유기체에서 염증 반응을 매개하는, 내인성으로 생산되는 발열 물질이다. 이들 내인성 발열 물질중 가장 중요하고, 잘 알려져 있는 것은 사이토카인 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8) 및 종양 괴사 인자(TNF) 및 저분자량 지질 매개 인자 프로스타글란딘 E2(PGE2)이다. 이들 화합물은 통상 ELISA, 또는 효소-결합 면역흡착 검정법(IL-1, IL-6, 또는 TNF에 대해), 및 EIA, 또는 효소 면역 검정법 (PGE2에 대해)에 의해 검정된다. 비경구적으로 투여되는 임의의 약물 또는 약제학적 제품의 발열 반응을 방지하고, 그의 안전성을 확보하기 위해 발열성 오염을 모니터하여 세균 오염물로 오염된 개개 로트(lots)를 확인하여야 한다. 대량-생산되는 약제학적 제품에서 발열 물질 오염을 모니터하기 위해 세균 내독소 시험(BET)으로도 지칭되는, 리물루스 암베오사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL) 시험과 토끼 발열 물질 시험, 상기 2개의 동물-기초 약전 방법이 현재 통상적으로 사용된다. 토끼 시험은 통계학적으로 유의적인 마릿수의 토끼에 샘플 화합물을 주사하고, 시험 동물에서 유도된, 평균 체온 상승에 관해 관찰하는 것으로 구성된 생체내 시험이다. 토끼 시험은 비-내독소 발열 물질을 비롯한 광범위한 발열 물질에 대하여 반응을 나타내지만, 토끼 시험은 다른 발열 물질 시험 (LAL 시험의 경우 (pg 내독소/ml)에 비하여 상대적으로 감수성이 낮다 (ng 내독소/ml). 추가로, 종간의 화합물에 대한 발열 반응의 상관관계는 잘 해야 유사할 뿐이다. 예를 들면, 발열 반응을 유도하는 세균 내독소의 용량은 종간에 10,000배 만큼이나 차이가 날 수 있다고 상세히 보도된 바 있다. 상대적인 비감수성, 열등한 정량적 결과, 토끼 종간의 변이성, 및 동물 시험에 관여하는 윤리적 문제로 인하여 최근에는 토끼 시험이 냉대시 되었다. 광범위한 발열 물질을 검출하는 토끼 시험과는 대조적으로, LAL 시험은 오직 내독소 발열 물질만을 검출한다. 그램-음성 세균의 세포벽으로부터 유래된 지질다당류(LPS)와 같은 세균 내독소는 가장 잘 기재되어 있는 발열성 화합물들중 하나이다 (문헌 ([Moltz et al., Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, 17, 237-269]; [Tilders et al., Psychoneuroendocrinology. 1994, 19, 209- 232]; [Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol 1994, 8, 1-10]; [Zeisberger and Roth, Neuropsychobiology, 1993, 28, 106-109])). 따라서, 일반적으로는 비용이 많이 들고, 시간이 많이 소비되는 토끼 실험을 세균 내독소에 대한 직접적인 LAL 시험으로 대체하는 것이 유용하다고 간주되었다. 이러한 접근법에는 뚜렷한 한계가 있다. LAL 시험은 매우 감수성인 시험관내 시험이지만; 오직 그램-음성 세균으로부터의 내독소만을 검출하고, 여전히 단핵구를 자극하여 발열성 사이토카인을 생성시킬 수 있는 특정 제품에 대하여 위 음성 결과를 나타낼 수 있다. 또한, LAL 시험은 예를 들면, 고단백질 수준의 시험 물질에 의한 또는 글루칸에 의한 간섭에 대하여 민감하다 (문헌 [Roslansky and Novitsky, J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2477]; [Fennrich et al., Dev. Biol. Stand. 1999, 101, 131])). 한편, 리물루스 시험은 감수성이 강하기 때문에 제품의 질과는 상관이 없는 불순물로 인하여 쉽게 위 양성 결과를 나타내는 경향이 있다 (문헌 [Fujiwara et al., Yakugaku Zasshi, 1990, 1 10, 332-340]). 따라서, 감수성이 높고, 특이성이 높으며, 광범위한 발열 물질을 검출할 수 있는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 비-동물-기초 시험 시스템을 필요로 하였다. 이러한 의도로, 그리고, 인간 염증 반응에 관한 더 많은 이해를 통해 인간 단핵구의 시험관내 활성화에 기초한 시험 시스템이 개발되었다. 20년전 몇몇 연구자들은 발열성 사이토카인의 방출을 모니터하여 내독소를 검출하기 위해 말초 혈액 단핵 세포를 사용하였다 (문헌 ([Dinarello et al., J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 323]; [Duff and Atkins, J. Immunol. Methods, 1982, 52, 323])). 그 이후로, 인간 말초 전혈 (WB), PBMCs, 또는 단핵구 세포주, 예로서, MONOMAC-6(MM6) (문헌 [Ziegler-Heitbrock et al., Int. J. Cancer, 1988, 41, 456]) 또는 THP-1 (문헌 [Tsuchiya et al., Int. J. Cancer, 1980, 26, 171])를 비롯한 상이한 기원의 인간 단핵구, 및 발열성 사이토카인 종양 괴사 인자 알파, TNF-α, IL-6, IL-1β, 및 비-발열성 대사 산물 네오프테린 (문헌 ([Hartung et al., The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 43, 2001, 29, 99]; [Poole and Gaines Das. Eur J Parenteral Sciences, 2001, 6, 63]; [Poole et al., J. Immunol. Methods, 2003, 274, 209]; [Gaines Das et al., J Immunol Methods, 2004, 288, 165]))를 비롯한 다양한 정보판독물(readout)을 사용한 수개의 상이한 시험 시스템이 개발되었다. 최근 공동으로 수행된 유럽의 연구, 휴먼 스터디(Human(e) Study)에서는 각각이 상기 기술된 세포 기원 및 정보판독물의 상이한 조합물을 사용하는, 6개의 가장 탁월한 단핵구 활성화 시험을, 다양한 농도의 순수한 내독소가 스파이크된(spiked) 의료용 제품내 내독소를 검출할 수 있는 능력에 대하여 평가하였다. 6개의 시험중 5개에서는 바닥이 평평한 웰을 갖는 96-웰 폴리스티렌 플레이트 상에서 세포를 배양하였다 (문헌 [Hoffmann et al., J. Immunol. Methods, 2005, 298, 161]). 6번째 시험 (문헌 ([Fennrich et al., Dev. Biol. Stand., 1999]; [Fennrich et al., ALTEX, 1999]; [Hartung et al., 2001])에 기초)에서는, 폴리스티렌으로 제조되고, 바닥이 원뿔형인 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리관 (1.2 ml)을 대부분의 평가에 사용하였고, 연구 도중, 바닥인 둥근형인 폴리프로필렌 관 (1.5 ml)은 본 연구에 사용된 엔도세이프® 인 비트로 피로젠 테스트(Endosafe® In vitro Pyrogen Test)(IPT)용 키트의 제조사인 찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories)에 의해 폴리프로필렌 관 대신 치환될 수 있다. 이러한 치환이 상기 시험에 대하여 임의의 유의적인 효과를 갖는다고 보고된 바는 없으며, 이후, 찰스 리버 라보라토리즈가 용량이 축소된 것을 위해 엔도세이프® IPT을 변형시켰을 때, 폴리프로필렌 관, 그 자체는 바닥이 평평한 폴리프로필렌 96-웰 플레이트로 대체하였다. 본 시험의 단핵구의 기원은 전혈이며, 정보판독물은 IL-1β이다. 상이한 농도의 내독소가 스파이크된 다양한 약물과 함께 전혈을 인큐베이션시켰다. 카린(Carlin) 및 비이타넨(Viitanen)은 단핵구 공급원으로서의 전혈 또는 MONOMAC-6 세포와 정보판독물로서의 IL-6에 기초하여, 각종 비-내독소 발열 물질, 즉, 디프테리아(Diphtheria) 톡소이드, 백일해(Pertussis) 톡소이드, 및 파상풍(Tetanus) 톡소이드를 비롯한 그램-양성 및 그램-음성 항원을 함유하는 백신 인판릭스(Infanrix)의 고유 발열성을 평가하는 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Pharmeuropa, 2003, 15, 3, 418-423]). 내독소-무함유의, 미공개 조성물의 에펜도르프 바이오-퓨어(Eppendorf Bio-Pure) 등급 튜브에서 세포를 낮은 세포 밀도로 배양하였다. 백신의 발열성은 그의 제조 또는 저장시의 백신 오염에 따른 결과가 아니었다. 아르퉁(Hartung) 및 헨델(Wendel)은 단핵구 공급원으로서의 전혈과 바람직한 정보판독물로서의 IL-1β에 기초하여, 순수한 형태의 내독소 및 비-내독소 발열 물질, 즉, 살모넬라 아보르투스 에쿠이(Salmonella abortus equi)로부터의 LPS, 스트렙토코커스 피로겐스(Streptococcus pyrogenes)로부터의 스트렙토라이신 O(SLO), 및 뮤라밀 디펩티드(MDP)를 검출하는 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Hartung and Wendel, In Vitro Toxicology. 1996, 9, 4, 353-359]; 미국 특허 번호 제5,891,728호). 세포를 폴리프로필렌 관에서 배양하였다. 야마모토(Yamamoto) 등은 단핵구/단핵구 세포 공급원으로서 상이한 인간 세포주로부터 유래된 전혈 또는 세포 (여기서, 단핵구/단핵구 세포가 바람직하다)와 바람직한 정보판독물로서의 IL-6에 기초하여, 내독소 발열 물질을 검출하기 위한 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Jpn. J. Infect. Dis., 2003, 56, 93-100]). 약물이 내독소의 발열성 효과를 증강시키는, 내독소와 비경구용 약물, 특히, 인터페론 사이의 생체내 상승작용의 가능성을 내독소 시험이 예측한다고 보고되었다. 세포를 순수한 형태의 내독소, 또는 순수한 형태의 내독소와 인간 인터페론의 혼합물과 함께 배양하였다. 세포주 세포를 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 구체적으로 명시되지 않는 물질을 포함하는 관에서 혈액 세포를 배양하였다. 나카가와(Nakagawa) 등은 단핵구 공급원으로서 전혈 또는 MM6-CA8 세포 (MONOMAC-6의 서브클론)와 바람직한 정보판독물로서의 IL-6에 기초하여, 순수한 형태의 내독소 및 비-내독소 발열 물질, 즉, E. 콜라이(E. coli) O55:B5로부터의 LPS 및 S. 아우레우스(S. aureus)로부터 유래된 불용성 펩티도글리칸(PG)을 검출하기 위한 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Clinical and Diagnostic Laboratory Immunol., 2002, 9, 3, 588-597]). MM6-CA8 세포를 폴리스티렌 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 혈액 세포를 폴리프로필렌 관에서 배양하였다; 사용량 (225 ㎕의 혈액, 25 ㎕의 시험 용액, 750 ㎕의 염수)에서 표준 96-웰 플레이트의 사용량 (250 ㎕/웰)은 배제하였다. 최근에는 다양한 출처를 통해 폴리프로필렌이 발열 물질 시험에 삼가되어야 한다고 제안되었다. 예를 들면, 찰스 리버 라보라토리즈는, LPS의 지질 A 성분과 관련된 수소성 도메인에 기인하여 폴리프로필렌 표면의 수소성 성질이 상기 표면 상에 내독소를 흡착시킬 수 있기 때문에 폴리프로필렌을 삼가할 것을 권고했다 (문헌 [Charles River Laboratories, Endosafe Times, Sept. 2004]). 생물학적 안전성 시험의 제작사인 할란 세라-랩(Harlan Sera-Lab)은 폴리프로필렌 관이 LAL 검정법을 간섭할 수 있다고 언급하였다 (문헌 [Harlan Sera-Lab, 2004 Catalogue]). 또한, 유럽 투석 이식 간호사 협회(European Dialysis and Transplant Nurses Association) 뿐만 아니라, 유럽 신장 관리 협회(European Renal Care Association)는, 폴리스티렌이 보통은 내독소를 흡착하지 않기 때문에 내독소 시험에서 폴리프로필렌을 삼가하고, 폴리스티렌을 사용할 것을 권고하고 있다 (EDTNA/ERCA 가이드라인). 따라서, 고도한 감수성, 고도한 특이성, 및 의료용 제품에서 광범위한 발열성 오염물을 검출할 수 있는 능력을 특징으로 하는, 비-동물-기초 발열 물질 시험이 요구되고 있다.