변이의 검출 방법 및 그것에 이용하는 키트 document_id A220623066426

모든 질환의 원인이나, 개체간의 질환역이환성(질환의 걸리기 쉬움), 개체간에 있어서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨d에서 해석하는 방법으로서, 점 돌연변이, 소위 단일염기다형(SNP)의 검출이 널리 행해지고 있다. 점 돌연변이의 일반적인 검출 방법으로서는 예컨대, (1) 시료의 표적 DNA에 대해, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 증폭시켜, 얻어진 증폭 산물의 염기 서열을 해석하는 Direct Sequencing법, (2) Pyrosequencing법, (3) 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 증폭시켜, 얻어진 증폭 산물에 대해 온도 경사 컬럼 내에서 HPLC를 행하여, 용출되는 시간에 따라 변이의 유무를 검출하는 Denaturing HPLC법, (4) 목적의 변이를 포함하는 영역에 형광 프로브가 결합하면 형광을 발하는 것을 이용하여, 상기 형광의 검출에 의해 변이를 검출하는 Invadar법, (5) 3''말단 영역에 목적의 변이가 위치하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 증폭의 유무에 따라 변이를 판단하는 ASP-PCR 법 등을 들 수 있다. 그러나, 상기 (1), (2) 및 (4)의 방법은 각각 약 20％, 약 5％, 약 5％ 정도로 감도가 낮고, 조작에 많은 수고와 시간이 걸린다. 상기 (3)의 방법은 감도가 약 10％로 낮고, 또한, 변이의 유무를 확인할 수 있을 뿐 어떤 부위에 어떠한 변이가 생긴 것인지를 해석할 수 없고, 특이성이 부족하다고 하는 문제가 있다. 또한, 상기 (5)의 방법은 감도는 높지만 특이성이 낮고, 위양성이 생기기 쉽다고 하는 문제가 있다. 또한, 감도는 수치(％)가 작을수록 고감도이다. 이러한 문제로부터 최근, 점 돌연변이의 검출 방법으로서, Tm 해석을 이용한 검출이 행해지고 있다. 이 방법은, 예컨대, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선, 검출 목적의 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 시료 중의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 따르는 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널 측정에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm치를 결정함으로써 점 돌연변이의 유무를 판단한다. Tm치는 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮게 된다. 이 때문에, 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해, 미리 Tm치(평가 기준치)를 요구하고 있고, 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브의 Tm치(측정치)를 측정하면, 이하와 같은 판단이 가능하다. 상기 측정치가 상기 평가 기준치와 동일하면, 매치, 즉, 표적 DNA에 점 돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 측정치가 상기 평가 기준치보다 낮으면, 미스 매치, 즉, 표적 DNA에 점 돌연변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 그러나, 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법은, 감도가 낮다고 하는 문제가 있다. 구체예로서, 백혈병 환자의 혈액 세포 유래 DNA에 대해 점 돌연변이를 검출할 때에 문제가 되고 있다(특허 문헌 1). 백혈병은, 골수 중의 조혈 줄기세포가 암화함으로써 발생하는 질환이다. 그 중에서도 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia: CML)은 9번째의 염색체와 22번째의 염색체의 전좌에 의해 형성되는 bcr-abl1 융합 유전자가 발증 원인으로서 알려져 있고, 그 치료에는, abl1 키나아제 억제제인 이마티닙(imatinib) 등이 널리 사용되고 있다. 그러나, 이 abl1 유전자(상기 융합 유전자에 있어서의 abl1 유전자를 포함한다)에 점 돌연변이가 존재하면, 이마티닙에 대해 내성을 발현한다고 하는 문제가 있다. 그 경우, 치료에 있어서, 예컨대, 이마티닙 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경, 골수 이식 등으로의 전환 등이 필요하게 된다. 따라서, 백혈병, 특히 CML의 치료에 있어서는, abl1 유전자에 있어서의 점 돌연변이의 유무를 검출하는 것이 매우 중요하게 되어있다. 그러나, 한사람의 CML 환자의 혈액이더라도, 그 혈액 세포에는 abl1 유전자에 점 돌연변이가 발생한 경우(검출 대상 서열)와 발생하지 않은 경우(비검출 대상 서열)가 포함되어 있고, 양자의 차이는, 점 돌연변이 즉 일염기의 서열에 지나지 않는다. 그렇다면, 점 돌연변이를 검출하기 위한 프로브는, 점 돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 하이브리드화(매치)하고, 또한, 점 돌연변이를 포함하지 않는 비검출 대상 서열에도 하이브리드화(미스 매치)하는 현상이 발생하게 된다. 이러한 경우에, Tm 해석에 따라 시그널의 강도와 온도의 관계를 나타내는 융해 곡선을 작성하면, 매치하고 있는 검출 대상 서열에 대한 고온측의 피크가, 미스 매치인 비검출 대상 서열에 대한 저온측의 피크의 존재에 의해 검출하기 어렵게 되고, 또한 검출 감도의 저하가 생기게 된다. [특허 문헌 1] 일본 특허 공표 제2004-537992호 공보