페그화된 돌연변이 클로스트리디움 보툴리눔 독소 document_id A220623066453

클로스트리디움 보툴리눔은 포자를 형성하는 박테리아로서, 혐기성 성장을 하며 매우 유해한 단백질을 형성한다. 이 이른바 보툴리눔 독소는 식중독인 보툴리누스 중독증의 원인이며, 이는 응급 조치가 없는 경우 환자가 치사할 수도 있다. 7 개의 혈청형(타입 A∼G, 간략히 BoNT/A, BoNT/B 등으로 불린다)으로 구분되며, 이 혈청형들은 유사한 아미노산 서열(서열)을 가지지만 상이한 항체 반응을 유발한다. 독소(하기에서 신경독소 및 보툴리눔 독소로 지칭한다)는 2 개의 기능적 사슬(chain), 즉 경쇄(∼ 50 kD)와 중쇄(∼ 100 kD)로 구성되며, 이들은 몇 개의 클로스트리디움 균주에서 단일 사슬의 전구체 단백질이 단백분해에 의해 절단되어 생성된다. 다른 균주들은 상응하는 프로테아제가 없기 때문에 사슬로의 절단은 우선 환자의 위-장관에서 행해진다(예컨대 트립신에 의해). 이중 사슬의 형태에서, 하위 단위(즉, 중쇄 및 경쇄)들은 이황화물 가교(disulfide bridge)에 의해 연결되어 있다(이 이외에, 예컨대 BoNT/A에서는 이황화물 가교가 분자 내에, 즉 중쇄의 2 개의 시스테인 잔기들 사이에 존재한다). 생체 내 산 조건 하에서, 순수한 신경독소는 자유형으로 존재하지 않고, 다른 방추형(clostridial) 단백질과 복합체, 이른바 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체를 형성한다. 이 복합체에는, 특히 적혈구를 응집시키는 특성을 갖는 여러 단백질이 들어 있다. 복합체의 조성은 혈청형마다 다르다. 이러한 복합체로의 통합에 의해 신경독소는 위장관을 통과하는 동안 보호된다. 이 방추형 단백질들(복합체를 형성하는 단백질 또는 복합체 단백질)은 신경독소의 재흡수시에도 역할을 한다. 즉, 이러한 복합체로서의 통합은 신경독소가 구강을 통해 생체이용가능하게 하고, 이로써 식중독을 일으키게 한다. 신경독소의 작용 장소는 근육이 신경에 의해 활성화되는 운동 뉴런 말단이다. 운동 뉴런은 근육을 활성화하기 위해 아세틸콜린(acetylcholine)을 방출한다. 보툴리눔 독소는 이 방출을 저지한다. 저지 작용은 3 개의 순차 단계로 실행된다: 결합, 전위(translocation), 단백분해. 보툴리눔 독소의 중쇄는 매우 특이적으로 운동 뉴런에 결합하고, 그 후 세포내이입에 의해 신경 세포내로 수용된다. 중쇄 C 말단에 위치하는 결합 영역의 상부 즉 중쇄의 N 말단에 전위 영역이 있고, 이 전위 영역은 지금까지도 정확히 알려져 있지 않은 기전에 의해 경쇄를 신경세포의 시토졸(cytosol)내로 운반하거나 또는 전위되게 한다. 시토졸에서 경쇄는 소위 SNARE 단백질을 매우 특이적으로 절단하는 프로테아제로 활성화된다. 개별 보툴리눔 독소 타입들의 단백분해 특이성을 표 1에 요약하였다. 이 SNARE 단백질은 아세틸콜린을 적재한 분비 소낭과 운동 뉴런의 세포막이 융합하도록 한다. 이 SNARE 단백질을 단백분해하여 절단하면 융합복합체의 형성 및 더 이상의 아세틸콜린의 방출을 저지한다. 침범된 근육은 더 이상 활성화되지 않는다. 그 전에 과활동성이던 근육들은 마비된다. [표 1] 이 작용 기전은 아세틸콜린의 제어되지 않은 방출을 특징으로 하는 다수의 디스토니아(dystonia) 및 경련(예컨대 안검 경련, 사경(torticollis), 강직(spasticity))의 치료에 이용된다. 디스토니아를 치료하기 위해 극히 소량의 신경독소(pg 내지 ng 범위)를 과활동성 근육 안으로 주입한다. 신경독소는 운동신경말단쪽으로 확산되고, 뉴런의 시토졸 내에 도달하여 아세틸콜린의 방출을 저지한다. 하루 이틀 후에 근육은 마비된다. 다양한 얼굴 주름은 피부 아래 근육의 경련에 의해, 즉 마찬가지로 아세틸콜린의 제어되지 않은 방출에 의해 생긴다. 보툴리눔 독소는 이와 같은 맥락으로 미용에 응용된다: 극히 소량의 보툴리눔 독소를 주입함으로써 주름살은 약 3 개월 동안 제거될 수 있다. 현재, 보툴리눔 독소를 포함하는 4 가지의 제제가 허가되어 있다: 보톡스® (Allergan), 제오민® (Merz), 디스포트® (Ipsen) 및 뉴로블록® (Solstice Neurosciences). 보톡스®, 제오민® 및 디스포트®는 보툴리눔 독소 타입 A의 동결 건조물이며(각각 복합체, 신경독소 또는 복합체로서), 보톡스® 및 제오민®는 각기 주사 용기당 100 유닛(unit)을 함유하고, 디스포트®는 500 유닛을 함유한다. 뉴로블록®은 보툴리눔 독소 B를 포함하며(복합체로서), 액상 포뮬레이션으로 5,000 또는 10,000 유닛을 함유한다. 뉴로블록을 제외한 상기 제제들은 동결 건조물로 존재하며, 이는 식염수로 재구성되어, 제제 및 증상에 따라 맞춰진 복용량으로 해당 근육 안으로 주입된다. 처치된 근육은 48 시간 내에 마비된다. 효과는 약 3 개월 동안 지속하며, 그 후에도 근육이 계속 마비된 상태로 있으려면, 즉 디스토니아가 치료되려면, 추가적으로 주입되어야 한다. 지금까지도 어떤 과정이 이러한 효과 감소를 조절하는지 명확히 규명되지 않았다. 경쇄가 프로테아제로서 활성인 한, 상응하는 SNARE 단백질은 절단된다(예컨대 신경독소 타입 A의 경쇄에 의해 SNAP 25). 그 결과, 이 조건하에서, 분비성 소낭과 세포막과의 융합 및 이로 인한 아세틸콜린의 방출은 저지되고, 근육은 마비된 상태로 존재한다. 세포 내 경쇄의 프로테아제 활성을 더욱 연장된 시간 동안 유지시킬 수 있다면, 상응하는 약제의 작용 지속시간도 연장될 것이다. 많은 저분자 활성 물질과는 달리, 단백질 활성 물질은 안정성이 매우 낮다. 혈액 순환에서의 반감기는 몇몇의 단백질 활성 물질에서는 예컨대 몇 분이며, 따라서 치료적 작용 지속시간은 매우 제한되고, 짧은 간격 내에 새로이 주입되어야만 한다. 단백질이 분해 및 제거되는 것에서 보호되면 반감기가 연장될 수 있다. 이론적으로 가능한 일 방법은 특히 진핵성 단백질에 대해 존재하는데 더 많이 글리코실화(많은 탄수화물 부분)하고, 탄수화물 구조를 인간 당단백질의 구조에 맞추는 것이다. 일련의 허가된 활성 물질에서 사용된 그외 방법은 단백질을 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 연결하는 것이다. PEG는 다양한 아미노산 잔기, 예컨대 리신 잔기들(아미노 기능기) 또는 시스테인 잔기(SH 기능기)에 공유 결합할 수 있다. PEG는, 작용 물질에 대한 항체의 형성을 유도하는 면역원성 구조를 만들지 않으면서, 단백질의 분자 무게를 증가시킨다. 오히려 페그화(pegylation)는 작용 물질의 면역원성(immunogenicity)을 감소시킨다. 분자 무게가 증가됨으로써 단백질은 보다 느리게 제거되고, 혈청 반감기가 현저히 상승된다. 요구되는 특정 혈청 농도를 유지하기 위해, 약제는 덜 자주 주입되어야 한다. 페그화된 단백질 활성 물질은 이미 몇몇의 허가된 약제에서 가공된바 있다(표 2 참조). 본래 형태 즉, 변형되지 않은 일부 작은 단백질들(예컨대 인터페론α2a: Mr = 19.3 kD)은 매우 신속하게 혈청에서 제거되었다. 페그화는 분자 무게를 현저히 상승시키고, 이로써 본질적으로 보다 긴 혈청 반감기를 초래한다. 예컨대 인터페론α2의 혈청 반감기는 9 시간인 반면, 40 kD PEG 사슬로 페그화한 경우 분자 무게가 현저히 상승하고 반감기가 9 시간에서 72 시간으로 연장된다. [표 2] 그러나, 하나 이상의 PEG 사슬과의 연결은 하기 제한에 종속된다: 1. PEG 사슬은 변형 단백질의 생물학적 활성을 (변형되지 않은 자연 그대로의 단백질과 비교하여) 바람직하게는 전혀 감소시키기 않거나 또는 단지 약간 감소시켜야 한다(본 발명에 있어, 변형 단백질의 약간 감소된 생물학적 활성이란 변형되지 않은 자연 그대로의 단백질의 생물학적 활성의 적어도 20%, 바람직하게는 30-40% 또는 50-70% 또는 심지어 75-95%에 해당하는 생물학적 활성을 말한다). 활성의 감소는 많은 경우에서 용인된다: 예를 들면, 페그화 인터페론의 항바이러스성 활성은 페그화되지 않은 인터페론α2b 활성의 25-35%이다. 심지어 페그화 인터페론α2a는 페그화되지 않은 형태의 활성의 단지 1-7%만을 가질 수도 있다. 2. 치료적으로 이용되는 다수의 단백질은 특정 수용체와의 결합을 통해 작용을 나타내기 때문에, 페그화는 수용체와의 상호 작용에 있어서 바람직하게는 영향을 끼치지 않거나 또는 약간만 영향을 끼쳐야 한다(상호 작용은 예컨대 결합 영역에서 공간 방해에 의해 직접적으로 영향을 받거나 또는 결합 영역에 영향을 주는 따라서 결합에 영향을 주는 단백질의 공간 구조의 변경에 의해 영향을 받을 수 있다). 3. 치료적 단백질의 약물학적 작용이 (또한) 효소 활성을 통해 전달되는 경우(예컨대 아스파라기나아제(asparaginase)의 경우와 같이), 페그화는 효소 활성을 바람직하게는 차단하지 않거나 또는 약간 차단하여야 한다. 보툴리눔 독소의 페그화는 바람직하게는 상기 3 가지 기준을 충족시킨다. 동시에 PEG로의 보툴리눔 독소의 변형은 바람직하게 (a) 중쇄의 결합 영역에도 영향을 끼치지 않으며 (b) 경쇄의 효소 활성에도 영향을 끼치지 않으며, 즉 PEG사슬은 기질(SNARE 단백질)과 경쇄 상의 촉매 영역의 상호 작용을 저지하지 않는다. 짧은 펩티드를 절단하는 다른 프로테아제와 달리, 보툴리눔 독소는 보다 긴 펩티드를 기질로 요구한다. 예를 들면 보툴리눔 독소 타입 B의 기질로 작용하는 펩티드는 바람직하게 SNARE 단백질 VAMP 2의 약 40 개의 아미노산 잔기 서열을 갖는다. 보다 짧은 SNARE 서열을 갖는 펩티드도 절단되기는 하나, 훨씬 더 적은 효율을 갖는다. 약 40 개의 아미노산 잔기의 인식 서열과 유사한 길이를 갖는 보툴리눔 독소의 경쇄 상의 절단 영역은 바람직하게는 PEG 사슬에 의해 영향을 받지 않는다. 게다가 고려할 점은, 기질(SNARE 단백질, 또는 대략 40 개의 아미노산 잔기의 SNARE 서열을 갖는 펩티드)과 경쇄가 직접 접촉하는 절단 영역 이외에, 촉매 영역에서 원격 위치하는 경쇄 상 서열들을 갖는 부가적 접촉 위치들이 보툴리눔 독소의 최적의 활성을 위해 필요하다는 것이다. 기질 SNAP 25에 대한 5개의 부가적 접촉 위치가 보툴리눔 독소 타입 A의 경쇄 상에 국재화되어 있는 것이 증명되었다: 4α 엑소사이트''(AS 102-113, 310-321, 335-348. 351-358) 및 β 엑소사이트''(AS 242-259). 바람직하게 상기 접촉은 경쇄와 PEG와의 콘쥬게이션에 의해 방해받지 않거나 또는 약간 방해를 받는다. 게다가, 중쇄의 C 말단, 전위 영역은 작동가능하여야 하며, 즉 경쇄가 엔도좀(endosome)으로부터 시토졸(cytosol) 안으로 확실히 수송되어야 한다. 작용을 위해 절대적으로 필요한 이 운반 과정은 페그화된 경쇄의 공간 방해에 의해서 저지될 수 있는데, 특히 전위 영역이 아마도 엔도좀의 막내에 미세한 구멍을 형성하고, 이 구멍을 '부피가 큰' 페그화된 경쇄는 관통할 수 없기 때문이다. US 특허출원(2002/0197278)에는 보툴리눔 독소에의 PEG의 결합이 기술되어 있다. 이 커플링은 항원성(antigenicity) 또는 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위해 그리고 분자 무게를 늘려 확산을 감소시키기 위해 사용되었다. 페그화에 적합한 위치(항원 결정기) 또는 아미노산 잔기의 선정은 Bavari et al.의 논문(Vaccine 16: 1850-1856, 1998)을 참조할 수 있다. 이 논문에는 중화 항체를 유도하는 보툴리눔 독소 중쇄 서열들이 개시되어 있다. 상기 특허출원에는 단지 (1)페그화는 중요한 에피토프(epitope)로서 작용하는 위치 그러나 촉매 영역에서는 떨어져 있는(즉, 경쇄로부터 떨어져 있는) 위치에서 또는 이 위치에 가까이 행해져야 하고, (2) PEG는 자유 말단 카복실기 또는 아미노산기 또는 리신(lysine) 측쇄의 아미노산기에 콘쥬게이트될 수 있다고 기술하고 있다. (3) PEG를 독소 안으로 도입하는 그 밖의 수단으로 자연 발생 또는 특별히 삽입된 시스테인 잔기들의 SH기를 사용하는 것이 제안되었으나, 그러나 이때 이 변이체(variant)(3)에 대해 조심해야 하는데, 왜냐하면 보툴리눔 독소의 중쇄와 경쇄 사이의 이황화물 가교는 분자의 공간적 형태에 있어 역할을 하기 때문이다. 페그화된 신경독소의 구조를 나타내는 예, 또는 어떤 아미노산 잔기(들)에 어떤 길이의 PEG 분자들이 부착되는지를 나타내는 예는 제시되어 있지 않다. 지속성의 변경에 관한 그 밖의 특허출원(WO 02/40506)에는, 보툴리눔 독소의 안정성을 선택적으로 높이거나 또는 감소시키기 위해, 보툴리눔 독소에서 생체내 글리코실화, 생체내 인산화 및 무엇보다 생체내 미리스틸화(myristoylation)를 위한 위치(site)의 삽입, 변경 또는 제거가 제안되었다. 이러한 일련의 잠재적인 변형 위치들이 제시되고, 이들은 신경독소 경쇄상에 그 N 및 C 말단에서 상당한 거리를 두고 위치한다. 이를 위해 추가적인 서열들이 폴리펩티드 사슬내 삽입되며, 탄수화물 사슬 또는 인산염 또는 미리스티레이트(myristylate) 부분들이 세포 효소에 의해 경쇄에 연결된다. 그러나, 이에 따라 변형된 신경독소 또는 그 제조는 제시되어 있지 않다. 그 밖에 US 특허출원(2003/0027752)에는, 신경세포 안에서 경쇄의 지속성을 높이기 위하여, 신경독소 내 또는 경쇄 내로 이른바 류신(leucine) 모티브를 갖는 펩티드 잔기(예컨대 XEXXXLL)를 삽입하는 것이 기술되어 있다. 상기 경쇄는 이 모티브를 갖춤으로써, 막에서 기질 가까이에 확실히 국재화될 수 있다. 그외 경쇄 안으로 삽입된 후 지속성을 높이는 이른바 '티로신 기반 모티브'(YXXHy, Y = 티로신, Hy = 소수성 아미노산)이 개시되어 있다. 최종적으로, 상기 출원은 경쇄가 돌연변이된 변형 보툴리눔 독소 타입 A를 제안하였다(427 위치 및 428위치에서 알라닌에서 류신으로 변경).