폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 효소 또는 미생물 형태의 생체촉매의 산업적 생산 방법, 이의 사용 방법, 및 이의 생산 장치 document_id A220623066674

폴리비닐 알코올 담체 또는 폴리우레탄 담체를 사용하는 미세 세균의 캡슐화가 당 분야에 공지되어 있다. 폴리비닐 알코올 겔(이후 본문에서, "PVA-겔"이라 칭해짐)에 배치된 미생물, 효소, 포자 및/또는 세포 형태의 생물학적 활성 물질을 이용하는 생체촉매의 생산 방법이, 체코 특허 제249 179호에 개시되어 있다. 생물학적 활성 물질을 위한 겔 담체로서의 PVA-겔은 화학적 또는 생물학적 촉매의 생산에 매우 적당하다. 본 방법에 따라 제조된 겔 본체(body)는 이전에 공지된 겔 본체에 비해, 특히 내마모성 및 인장 강도 측면에서 더 높은 기계적 안정성을 나타낸다. 상기 언급된 향상된 기계적 성질로 인해, 반응성이며 운동학적으로 적당한 렌즈 형상 형태의 겔 본체의 생산이 가능하다. 이와 같이 생산된 겔 본체는, 이전에 공지된 것들에 비해, 높은 공전 교반 시에도 수개월 초과 기간 동안, 단단하며, 내마모성이다. 큰 직경 및 적은 높이를 특징으로 하는 렌즈 형상 형태로 인해, 물리학적, 화학적 또는 생물학적 활성 물질은 항상 표면 아래에 근접하게 위치하며, 그 물질의 반응성 및 운동학적으로 유용한 배열을 제공한다. 생물학적 활성 물질의 담체로서 PVA-겔을 이용하는 생물공학적 절차가 당 분야에 공지되어 있다. 폐수로부터 질소를 제거하는 공정에서의 상기 언급된 담체의 이용이 공지되어 있다. 이러한 이용은 예를 들어, 유럽 특허 제0758680호(다공성 셀룰로스 유도체), WO 제09508513호(폴리비닐 알코올, 질석, 폴리우레탄) 및 체코 특허 제1076488호(폴리비닐 알코올)에 기재되어 있다. 상기 언급된 담체는 다양한 방법으로, 특히 질화 세균에 의해(예를 들어, 페가수스(PEGASUS) 또는 페가주르(PEGAZUR) 공정), 또한 순수한 질화 또는 탈질화 세균의 고정화에서 직접적으로 이전에 풍부화된 활성화 슬러지의 고정화에 (통상) 사용된다. 문헌을 참고해 보건대, 담체의 매우 중요한 특성은 반응기의 부피, 또는 보다 정확하게는 현재 처리되고 있는 폐수의 부피에 관한 담체의 비표면적의 정도이다. 즉, 이 매개변수는, 반응기 내에 배치되는 소정의 비표면적을 갖는 담체의 양(더욱 정확하게는, 중량 또는 부피)에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 반응기의 크기 및 반응기 내 폐수의 보유 시간과 직접적으로 관련된다. 예를 들어, 기하학적 치수 S/V=3 및 2를 갖는 정제 형태의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 담체에 고정화된 세균에 의한 질소 오염 제거 공정으로 인해, 담체 중 활성화 슬러지의 2 %w/v 바이오매스의 함량으로, 1일 당 0.34 ㎏/㎥ 내지 1.14 ㎏/㎥의 질소 제거율을 달성할 수 있다. (문헌 [T. Sumino, H. Nakamura, N. Mori, Y. Kawaguchi: Immobilization of Nitrifying Bacteria by Polyethylene Glycol Prepolymer, Journal of Fermentation and Bioengineering, 73(1), 37-42, 1992]). 그러나, 담체의 부피, 더욱 구체적으로 담체의 형태 및 치수에 대한 담체의 비표면적(기하학적 표면적)의 정도는, 특히 경제적 이유로 동질의 매개변수이다. 그 형상이 바닥 직경(d) 및 높이(h)가 대략 동일한 값인 공 또는 원통형에 근사한 담체가, 고정화 세포에 의해 하수도 물로부터 질소를 제거하는 데 여전히 사용된다. 폐수로부터 질소를 제거하기 위한 담체의 최소 측정값은 1 ㎜이다. 통상적으로 사용되는 담체의 측정값은 3 ㎜이며, 이는 담체의 표면 대 부피 비율(S/V)이 대략 2 ㎜-1 내지 6 ㎜-1의 값임을 의미한다. 만약 렌즈 형상 또는 밴드 형상의 담체가 사용되면, 동일하거나 더 높은 강도의 공정에서도, 음용수, 산업용수 및 폐수로부터의 질소 화합물의 제거를 위해 고정화 세포를 사용하는 현 공정들에 비해 더 적은 생체촉매가 사용될 수 있다. 생물공학적 공정에서 겔 담체의 또 다른 대안적 용도는 락트산 생산을 위한 방법에서의 용도이다. 이 산은 특히 식품, 제약 및 화학 산업에서 광범위하게 사용되고 있다. 락트산은 다수의 미생물에 의해, 단 주로는 섬유상 진균류 및 세균에 의해 생산된다. 섬유상 진균류 중 리조프수스 아리주즈(Rhizopsus arrhizuz) 또는 오리자에(oryzae)가 우수한 락트산 생산자이다. 세균과 비교되는 이의 명백한 이점은 정확한 산 L(+)을 생성한다는 사실이다. 그러나, 발효 방식은 호기성 (높은 무균 공기 제조 필요 조건)이다. 섬유상 진균류의 호기성 방식은 직접적인 락트산 칼슘 염 제조의 경우에서 유리할 수 있고, 그러한 제조 과정 중 발효의 연장 및 수율의 감소가, 탄산칼슘의 경우에 비효율적인 중화(약한 교반)의 결과로서 일어날 수 있다. (문헌 [Mattey M.: Critical Reviews in Biotechnology 12, 87-132, 1992]). 세균 발효의 이점은 이의 혐기성 방식 및 이에 따른 배양 장치의 단순성 및 낮은 무균 요건에 있다. 30℃ 내지 40℃의 온도에서 수크로스 기질(글루코스, 수크로스, 락토스)을 생산자의 특성에 따라 상이한 L(+)-, D(-)- 및 DL 산 형태 함량을 갖는 락트산으로 전환하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 세균의 산업적 생산에 주로 사용된다. 겔 담체로의 캡슐화에 의한 미생물의 고정화는 완전히 발효된 배지 내 바이오매스 성장 없이 반응기 내에 바이오매스가 농축되도록 하는 방법들 중 하나이다. 이 방법은 천연 또는 합성 겔의 캡슐로 세포를 봉입하는 것으로 이루어진다. 세포는 담체의 세공보다 더 커서, 세포 방출이 일어나지 않아야 하는 동시에, 기질 및 생성물의 캡슐화된 세포로의 자유로운 확산을 보장해야 한다. 상이한 담체로의 락트산 세균의 고정화가 현재 공지되어 있다. 그 중에서도, 천연 겔의 카라기난, 펙테이트, 알긴산염(문헌 [Norton, S. 등: Enzyme Microbial Technol 16, 457-466, 1994; 문헌 [Richter, K. 등: Acta Biotechnol. 11, 229-341, 1991; 문헌 [Yan, J. 등: Chem. Biochem. Eng. Q; 15(2), 59-63, 2001]), 및 합성 담체의 폴리아크릴아미드(문헌 [Tuli, A. 등: Enzyme Microbial Technol. 7, 164-168, 1985])가 있다. 고정화물은 통상 관련 겔의 경화 용액으로의 적하에 의해, 3 ㎜ 내지 5 ㎜ 직경을 갖는 공 형태로 생성된다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 공 형태의 고정화물이 공 내측의 확산 한계를 유발한다는 것이다. 전체 겔 부피가 사용되지 않으며, 그 결과 미생물은 공의 표면 바로 아래에서만 성장한다. 고정화의 또 다른 적당한 방법은 폴리비닐 알코올 겔 내로의 락트산 세균 캡슐화이다. 이는 다른 담체에 비해 수많은 이점을 갖는다. 무엇보다도 이는 저렴하고, 미생물에 대해 비독성이며, 거의 생분해되지 않으며, 우수한 물리-기계적 특성을 가지며, 미생물에 대한 어떠한 부작용도 없으며, 장기간 안정성을 나타낸다(독일 특허 제198 27 552.8호). 또한, 상기 언급된 발명에 따른 방법에 의한 세포의 고정화는, 매트릭스의 가교결합이 건조 공기의 스트림 중에서 일어나, 동결에 의한 가교결합(독일 특허 제43 27 923호) 또는 붕산을 이용한 시스템에서의 경화(미국 특허 제5 290 693호)의 현재 사용된 절차를 대체하기 때문에, 생산성 미생물에 대해 중요하다(고정화 후 미생물의 높은 생육성 및 고정화 절차 후 높은 미생물 생존율을 보장함). 또한, 렌즈 형상 형태의 고정화물은 미생물의 성장 및 락트산의 생성에 대한 담체의 전체 부피의 최적 로딩을 보장한다. 이 방법으로 제조된 고정화물은 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 작동 방식에 반복적으로 사용될 수 있다. 발효 공정 동안 글루코스 및 기타 당류를 에탄올로 전환할 수 있는, 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 기타 효모 미생물이 에탄올의 생성에 종래부터 사용되고 있음이 일반적으로 공지되어 있다. 이 발효는 맥주 및 와인 생산의 기초이며, 또한 산업적인 식품 및 연료 목적을 위한 에탄올 생산의 기반이다. 최근, 에탄올의 생산자로서 세균을 사용하는 기술에 대한 관심이 증가하고 있음이 나타났다. 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)가 에탄올의 세균 생산자들 중 하나이다. 이는 그램 음성 조건적 혐기성 미생물이다. 이는 효모에 비해 몇가지 이점들, 즉 바이오매스의 보다 빠른 성장(단, 일반적으로 보다 낮은 바이오매스 생성), 기질 이용율 및 비교적 높은 생성물 발생의 특정 특이적 속도를 가지며, 모니터링되는 산소 공급을 요구하지 않으며, 대사 부산물을 덜 생성한다. 이는 혐기성 미생물을 이용하여 통상 일어나는 엔트너-도우도로프(Entner-Doudoroff) 경로에 의해 글루코스 및 프룩토스를 대사한다. 이 대사 경로에서, 1 몰의 글루코스는 2 몰의 에탄올, 2 몰의 CO2 및 1 몰의 ATP로 전환된다. 이 대사 경로는 바이오매스로 변화된 글루코스의 양을 최소화하며, 이러한 방식으로 에탄올 생산이 증가한다. 실제 수율(g 알코올/g 글루코스)은 세균으로는 0.49로 상승하며, 효모로는 통상 0.44이다. 유리 자이모모나스 모빌리스 세포의 보조 하에서의 발효는 회분식, 반연속식 및 연속식 작동 방식으로 일어날 수 있다(Rogers P.L., Tribe D.E.: 미국 특허 제4403034호; Rogers P.L. 등, 미국 특허 제4443543호; Salzbrunn W. 등, 미국 특허 제4876196호; Bu'lock J.D., 영국 특허 제2075053호). 현재까지, 조사 관심은 미생물 생산성의 증가 및 다양한 개혁, 예를 들어 세포 재생, 응집 미생물의 사용 등으로 발효 장치의 배열 개선에 초점을 맞춰 왔다(Arcuri E.J. 등, 미국 특허 제4413058호; Rogers P.L. 등, 미국 특허 제4443544호). 발효 생산물(에탄올)이 액체 배지에 축적되며, 증류에 의해 거의 전부 분리된다. 생산물 분리 동안, 사용된 배열 및 기술에 관계없이, 침강, 원심분리, 여과 등에 의해 바이오매스 함량을 상당히 감소시키는 것이 바람직하다. 상승된 불용물 함량은 증류 에너지 요건을 증가시키고, 기술적 문제(증류 장치의 오염, 발포 등)를 일으키고, 유지 요건을 증가시키며, 또한 생산물 품질에 영향을 줄 수 있다. 한편, 에탄올 생산의 최대 효율이 달성되어야 한다. 에탄올 생산율은 발효기 중 바이오매스의 양에 직접적으로 비례한다. 이는, 일정한 조건 하에서 증가된 바이오매스 함량이 소정량의 에탄올의 생산에 필요한 시간을 단축시킴을 의미한다. 방법들 중 하나로서, 철저히 발효된 배지 중 바이오매스 성장 없이 반응기 중 바이오매스를 농축시킬 수 있도록 하는 겔 담체 내의 캡슐화에 의한 미생물 고정화이다. 이 방법은 천연 또는 합성 겔 캡슐로의 세포 캡슐화에 기초한다. 세포 크기는, 세포 방출이 일어나지 않아야 하나, 이와 동시에 캡슐화된 세포로의 기질 및 생성물의 자유로운 확산이 보장되도록 담체의 세공 크기보다 커야 한다. 각종 담체 내에서의 세균 자이모모나스(Zymomonas) 속의 고정화가 현재 공지되어 있다. 그 중에서도, 천연 겔의 알긴산염 및 카라기난(Cheetham P.S.J., 미국 특허 제4393136호; Chibata I., 미국 특허 제4350765호; Kikuta M, 미국 특허 제5990191호; Yamada T. 등, 미국 특허 제4680263호), 및 합성 담체의 폴리아크릴아미드(Yamada T. 등, 미국 특허 제4680263호; Cheetham P.S.J., 미국 특허 제4393136호)가 있다. 고정화물은 통상적으로, 대부분 관련 겔의 경화 용액으로의 적하에 의해, 3 ㎜ 내지 5 ㎜의 직경을 갖는 공 형태로 생성된다. 그러나, 그러한 방법의 단점은, 공 형태의 고정화물이 공 내부의 확산 한계를 유발한다는 것이다. 전체 겔 부피는 세포 로딩에 대해 사용되지 않으며, 결과적으로, 미생물은 담체-공의 표면 바로 아래에서만 성장하며, 매트릭스의 전체 부피를 로딩하지 않는다. 적절한 고정화 방법은 세균 자이모모나스 모빌리스의 폴리비닐 알코올 겔 내로의 캡슐화이다. 이는 다른 담체에 비해 다수의 이점을 갖는다. 무엇보다도, 이 방법은 저렴하고, 미생물에 대해 비독성이며, 거의 생분해되지 않으며, 우수한 물리적-기계적 특성을 가지며, 미생물에 대한 어떠한 부작용도 없으며, 장기간 안정성을 나타낸다(독일 특허 제198 27 552.8호). 또한, 상기 언급된 발명에 따른 방법에 의한 세포의 고정화는, 매트릭스의 가교결합이 건조 공기의 스트림 중에서 일어나, 동결에 의한 가교결합(독일 특허 제43 27 923호) 또는 붕산을 이용한 시스템에서의 경화(미국 특허 제5 290 693호)의 현재 사용된 절차를 대체하기 때문에, 생산성 미생물에 대해 중요하다(고정화 후 미생물의 높은 생육성 및 고정화 후 생존 미생물의 높은 비율을 보장함). 또한, 렌즈 형상 형태의 고정화물은 미생물의 성장 및 락트산의 생성에 대한 담체의 전체 부피의 최적 이용을 보장한다. 이 방법으로 제조된 고정화물은 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 방식에 반복적으로 사용될 수 있다. 공 형상 형태의 고정화물을 사용하여, 에탄올 생산은 4 ㎜의 고정화물 직경을 갖는 고정화물 20 ㎖로 충전된 500 ㎖ 회분식 반응기에서, 또한 30℃의 온도에서, 글루코스 배지 10 중량%로, 카라기난 내로 고정화된 자이모모나스 모빌리스의 보조 하에, 77 ㎎에탄올/㎖겔/h였다(Chibata I., 미국 특허 제4350765호). 생산자가, 고정화물 내 습윤 세포 중량이 20 중량%w/v(ww-습윤 세포 중량, 건조 세포 중량의 1/5에 상응함)을 포함하는 알긴산나트륨 내로 고정화될 때, 동일한 조건 하의 생산성은 회분식 시스템에서 0.49 g에탄올/gww/h(이는 재계산 후 98 ㎎에탄올/㎖겔/h에 상응함)였으며, 연속식 방식에서는 0.47 g에탄올/gww/h(이는 디지트 재계산 후 94 ㎎에탄올/㎖겔/h에 상응함)였다(Cheetham P.S.J., 미국 특허 제4393136호). 생물공학 공정 중 겔 담체의 대안적 용도는, 고정화 효소 인버타제의 보조 하에, 수크로스로부터 글루코스 및 프룩토스를 생성하는 방법에서의 용도이다. 수크로스는 사탕무 및 사탕수수 중에 주로 존재하는 저장 이당류이다. 이는 식품 산업에서, 또한 발효 공정에서 기질로서 사용된다. 이는 단당류 글루코스 및 프룩토스로 구성된다. 수크로스는 가수분해에 의해, 예를 들어 효소 인버타제를 사용한 효소적 가수분해에 의해 상기 단당류를 제공한다. 그 사용 결과, 글루코스 및 프룩토스(전화당)가 생성되며, 이는 가수분해되지 않은 수크로스에 비해 다수의 이점, 즉 결정 혼탁의 생성 감소, 감도 증가, 및 발효 공정 중 유용성을 가져온다. 산업적 실무에서, 재순환가능하지 않은 인버타제의 효소 제조가 수크로스 가수분해에 사용된다. 이는, 효소가 글루코스-프룩토스 시럽의 제조에 있어 가장 큰 경제적 항목들 중 하나가 되는지의 이유이다. 이 효소의 적당한 고정화 방법은 이의 다중 용도를 제공하며, 또한 전체 제조 공정이 연속적으로 되도록 함으로써, 그 효과능이 현저히 증가한다. 가장 빈번히 사용된 기법은 가교결합이다. 가장 통상적으로 사용된 가교결합제는 폴리아미드(Sou M. 등, 일본 특허 제58086085호, Rohrbach R.P. 등, 미국 특허 제426842호), 글루타르알데히드(Lee D.M. 등, 미국 특허 제4749653호), 비조합 카르복실기를 갖는 중합체(Mauz O., 미국 특허 제4767620호), 에폭시드기를 갖는 중합체(Mauz O., 미국 특허 제4931476호), 광가교결합 역청 내로의 고정화(Kunihiro I., 일본 특허 제55023941호) 및 가교결합제의 보조에 의한 각종 매트릭스 상에의 매립, 예컨대 글루타르알데히드의 보조에 의한 유리 공 상에의 고정화(Toshiyuki Y. 등, 일본 특허 제58179494호)이다. 기타 방법은 글루타르알데히드의 보조에 의한 실리카 겔 입자 상에의 인버타제의 공유 부착(Thibault P.A. 유럽 특허 제0231668호), 유기 및 무기 담체 상에의 디술피드 결합의 보조에 의한 공유 결합(Cormier R.A. 등, 미국 특허 제4176006호), 오르가노실란의 보조에 의한 공유 결합(Ho G.H. 등, 미국 특허 제4384045호), 셀룰로스 및 리그닌 물질 상에의 디알데히드의 보조에 의한 공유 결합(Monsan P., 미국 특허 제4405715호) 및 디알킬아미노알킬 셀룰로스 상에의 공유 결합(Lapins Ch. D. 등, 미국 특허 제4933284호)이다. 인버타제는 또한 예를 들어 동물 뼈로부터의 매트릭스 상의 흡착에 의해 고정화되었다(Findlay Ch. J., 미국 특허 제5037749호). 또 다른 방법은 알긴산염 겔(Obana H. 등, 일본 특허 제57163484호, Chang H.N. 등, 미국 특허 제5766907호) 또는 폴리우레탄 중합체(Hartdegen F.J. 등, 미국 특허 제4098645호)로의 고 인버타제 활성을 갖는 세포 분해물의 캡슐화이다. 조합 기술, 예를 들어 폴리에틸렌이민에 의해 처리된 면 상에 효소의 흡착, 및 이에 이은 글루타르알데히드에 의한 후속 가교결합(Yamazaki H. 등, 캐나다 특허 제1203187호)도 또한 실질적 유용성을 갖는다. PVA(폴리비닐 알코올 겔)의 사용은 매우 우수한 대안인 것으로 나타난다. 인버타제는 PVA 겔에 의해 덮혀진 고체 중심을 갖는 담체 내로 성공적으로 고정화되었다(Yamamoto H. 및 koet 등, 일본 특허 제2005042037호). 폴리에틸렌 글리콜과 혼합된 광가교결합 PVA가 또한 공유 결합 및 인버타제 봉입에 사용되었다(Ichimura K., 일본 특허 제58152483호, Suehiro T. 등, 일본 특허 제1252285호, Izumida H. 등, 일본 특허 제1071491호). PVA 매트릭스는 또한 붕산에 의해 가교결합될 수 있는 반면, 인버타제는 겔 상으로(Guocheng Ch. 등, 체코 특허 제1076488호), 또는 건조에 의해(Ishimura F 등, 미국 특허 제4727030호) 캡슐화된다. 기타 방법이 또한 가교결합(Tsutsumi S. 등, 일본 특허 제2046288호), 또는 아세트산비닐의 첨가(Moriya T. 등, 일본 특허 제56113290호), 비닐 아민의 첨가(Moriya T. 등, 일본 특허 제56113292호) 또는 아미노아세탈화 PVA의 첨가(Yamauchi A. 등, 미국 특허 제4307151호)와 조합하여 사용되었다. 생물공학적 공정에서 겔 담체의 대안적 용도는 고정화 글루코아밀라제 효소의 보조에 의한 전분으로부터 글루코스 생성의 방법에서의 용도이다. 식물의 영양 저장 물질인 전분은 식품 산업 및 발효 산업에서 글루코스의 주요 공급원들 중 하나이다. 전분은 2가지 유형의 분자, 즉 아밀라제 및 아밀로펙틴을 포함한다. 아밀라제는 예를 들어 옥수수 내에서는, 전체 전분의 10%를 나타낸다. 이는 α-1,4-글리코시드 결합에 의해 연결된 1000개 이하의 글루코스 단위를 구성한다. 나머지 90%는 α-1,4-글리코시드 결합과 별도로 α-1,6-글리코시드 결합이 또한 포함된 아밀로펙틴을 나타낸다. 사슬 내 글루코스 단위의 수는 10000 이하이다. 발효 공정에 사용하기 위한 전분 원료 물질의 예비 처리 공정은 2단계로 이루어진다. 제1 단계에서, 세포내 효소 α-아밀라제의 보조에 의한 전분 액화가 일어나며, 이는 고온에서 α-1,4-글리코시드 결합을 무작위적으로 해리한다. 이 반응은 덱스트린의 형성 및 상이한 사슬 길이들을 갖는 저급 올리고당의 형성을 유발한다. 제2 단계에서, 덱스트린 및 올리고당이 세포외 효소 글루코아밀라제에 의해 비환원 말단으로부터 글루코스 단위로 해리된다. 글루코아밀라제는 α-1,4- 및 α-1,6-글리코시드 결합 모두를 해리한다. 그러나, α-1,6-글리코시드 결합이 훨씬 낮은 속도로 가수분해된다. 가수분해의 속도도 또한 사슬 길이에 의존한다. 산업적 실무에서, 전분 1톤 당, 재순환가능하지 않은 글루코아밀라제 효소 제제의 1 ℓ 내지 1.2 ℓ가 사용된다. 상기 효소의 적당한 고정화는, 전체 공정을 연속적으로 만드는 가능성과 함께 그 효소의 다중 사용을 허용할 것이다. 폴리아민(Symon 등, 미국 특허 제4415663호, Lantero 등, 미국 특허 제5472861호, DeFilippi 미국 특허 제4343901호, Rohrbach 등, 미국 특허 제4268423호), 글루타르알데히드(Lee 등, 미국 특허 제4749653호, Nishimura 등, 미국 특허 제4888285호, Rorvah 등, K.R. 제8601229호), 아크릴 또는 알릴 제제(Boross 등, 미국 특허 제4794083호, Selemenev 등, RU 제2204600호)와 같은 제제를 이용한 가교결합에 의한 효소의 고정화로 상당한 개선이 달성되었으며, 이에 의해 효소가 무기 또는 유기 매트릭스 상에 놓이게 된다. 흡착 방법(Abdullah 등, 미국 특허 제4226937호, Kumakura 등, 일본 특허 제61060700호, Motai 등, 일본 특허 제59232092호, Selemenev 등, R.U. 제2181770호, Kimura 등, 일본 특허 제63056297호), 및 고정화 글루코아밀라제를 이용한 막 반응기(Thomas 등, 미국 특허 제5130237호)의 사용이 적당한 것으로 보인다. 생물학적 물질이 겔 구조 내로 캡슐화하며 미생물 고정화에 주로 사용되는 캡슐화는, 글루코아밀라제 고정화 과정 동안 전적으로 부재이다. 그러나, 더 큰 구조로의 가교결합 없이, 효소는 매트릭스 세공으로부터 쉽게 세정 제거된다. 생물공학 공정에서 겔 담체의 대안적 용도는 락토스 용액 가수분해, 및 고정화 β-갈락토시다제의 보조에 의한 락토스 용액으로부터 D-갈락토스, D-글루코스 및 갈락토올리고당류의 생성 방법에서의 용도이다. 이당류 락토스는 대부분의 포유류의 유선에서 합성된다. 이는 유장으로부터의 추출에 의해 소의 우유(락토스 함량 4.5% 내지 5 중량%)로부터 상업적으로 생산된다(Baldrick 및 Bamford, 1997). 우유 및 유제품 중에 존재하는 락토스는 중요한 영양분이다. 그것은 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종의 성장을 지지하고, 갈락토리피드 및 갈락토올리고당류의 생성에 필요한 갈락토스의 공급원이며, 칼슘 흡수를 돕는 등의 기능을 한다(Maldonado 등, 1998). 그것은 낮은 용해도를 가지며, 18 중량% 초과의 농도에서 결정화한다. 이는, 락토스 결정이 유제품, 예컨대 연유 및 아이스크림의 생산 시에 불쾌한 모래같은 감촉을 일으키기 때문에(Zadow, 1992) 문제가 있는 것으로 보인다. 이는 이들 제품에 락토스 가수분해가 매우 요망되는 이유이다. 또한, 락토스 가수분해는 건조 유제품의 흡습성의 상당한 감소 및 감도의 증가를 유발하며, 마이얄 반응의 공정이 감소된다(Curda 등, 2001, Zadow, 1992, Rosenberg 등, 1995). β-갈락토시다제는 우유 중 락토스 가수분해에서 중요할 뿐 아니라, 유장 가공에서 또한 중요하다. 유장은 치즈, 부드러운 백색 치즈 및 카제인의 생산 과정 동안 낙농 산업의 부산물로서 매우 다량 제조된다. 치즈 생산 동안, 연간 세계적으로 1.5억톤의 유장이 제조되며(평균 유장 10 ℓ/치즈 ㎏), 전세계 치즈 생산이 꾸준히 증가해오고 있다. 유장은 여전히 광위적으로 가공되지 않으며, 이는 경제적 및 환경적 문제를 나타낸다(Novalin 등, 2005). 또한, 이의 취급은 많은 제한을 수반하며, 환경으로 자유롭게 방출하는 것이 가능하지 않다. 생성된 폐 생성물의 반이 유장 단백질 농축물(WPC)의 생산에 사용되나, 주로는 주로 농장 동물 급식에 사용된다(Rudolfova 및 Curda, 2005). 유장은 또한 에탄올 생산을 위한 원료 물질로서 사용될 수 있다. 이 사실을 고려해 볼 때, 이는 미래 발효 공정에 대해 매력적인 물질일 수 있다(Cote 등, 2004). 예를 들어, 에탄올 생산 동안, 락토스를 이용하는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 효모를 사용하는 것이 가능하다. 락토스 가수분해는 기질로서 더 높은 농도의 C-공급원을 갖는 농후 유장의 사용을 가능하게 함으로써 발효 수율을 상당히 증가시킨다(Rosenberg 등, 1995). 일부 경우에, 생산성 미생물이 존재하는 글루코스만을 이용하는 방식으로 발효 공정을 수행하는 것이 가능한 한편, 잔여 갈락토스는 이후에 분리되거나, 정제되거나, 화학적으로 개질될 수 있다(Rosenberg, 2000). 식품 산업에서 β-갈락토시다제의 또 다른 유의적인 용도는 갈락토올리고당류(GOS)의 생성에서의 용도이다. 그것은 β-갈락토시다제의 트랜스글리코자일레이트 활성으로 인한 락토스 가수분해 과정 동안 동시에 형성된다. β-갈락토시다제 트랜스글리코자일레이트 활성은 1950년대에 처음 기재되었다(Aronson, 1952). 첫 번째로 공개된 연구는 GOS의 바람직한 효과의 모니터링 및 최적으로 그것의 생산 방법의 검색에 초점을 맞추었다(Mahoney, 1998). GOS는 소위 프로비오틱, 즉 인간 소화관 내 프로비오틱 배양액의 성장, 또는 더욱 구체적으로는 활성을 선택적으로 자극하는 비소화성 식품 성분의 군에 속한다. GOS는 그것의 β-배열로 인해, β-글리코시드 결합을 선택적으로 가수분해하는 침 및 소화액 효소에 의한 가수분해에 대해 내성이 있다(Sako 등, 1999). GOS는 대장으로 들어가, 거기에서 많은 중요한 공정에 관여한다. 비피도속 미세 식물군은 GOS를 단쇄 지방산(아세트산, 프로피온산, 락트산 및 부티르산) 및 가스로 대사한다(Johnson 등, 1993). 초기 산은 장의 연동 운동을 자극하며, pH를 감소시킴으로써 칼슘 및 철의 흡수를 돕는다. GOS는 또한 그들의 이로운 건강 효과로 인해 인식되어진 비피도박테리아 성장 인자로서 공지되어 있다. 또한, 비피도박테리아는 소화관 내 바람직하지 못한 미생물의 성장을 억제하는 선택적으로 갈락토올리고당류를 이용한다(Pennisin, 1997). GOS는 또한 구내 미세식물군(스트렙토코커스 돌연변이(Streptococcus mutants))에 의해 이용되지 않을 때 구강 건강에 유리하며, 따라서 충치의 형성을 방지한다(Szilagyi, 1999). 개별 β-갈락토시다제는 생성된 GOS의 전체 양 및 구조에 있어 상이하다. 예를 들어, 비피도박테리움 속의 상이한 균주로부터 β-갈락토시다제를 단리하고, 후속하여 30% 락토스 용액으로부터 GOS 합성 과정 동안 이들을 사용한 후, 생성된 양에 명백한 차이가 있었다. 비피도박테리움 안굴라툼(Bifidobacterium angulatum)의 경우, β-갈락토시다제는 용액 중에 존재하는 모든 당류의 43.8%를 형성한 반면, 비피도박테리움 슈도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum)의 경우에는, 단지 26.8%였다(Rabiu 등, 2001). 구조에 관하여, 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans) 중의 β(1-4)(Mozaffar 등, 1984), 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 중의 β(1-6)(Matsumoto, 1990)과 반대로, 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) β(1-3)(Dumortier 등, 1994)의 경우에서는, 2개의 단당류 단위 (갈락토스-갈락토스, 갈락토스-글루코스)의 새로이 형성된 글리코시드 결합의 유형이 있다. 효소인 β-갈락토시다제는 하기 방법으로 고정화되었다: 포획(Mammarella 및 Rubiolo, 2005, Rodriguez-Nogales 및 Delgadillo, 2005), 가교결합(Sungur 및 Akbulut, 1994), 흡착(Carpio 등, 2000), 공유 결합(Hu 등, 1993, Findlay, 1991, Di Serio 등, 2003), 막 내 봉입(Novalin 등, 2005), 또는 이들 방법의 조합(1.2.1부에서 더욱 상세히 설명됨). β-갈락토시다제 고정화 공정은, 고정화 후 효소 활성의 손실과 같은 특정 단점과 결부된다. 고정화 후 β-갈락토시다제 활성의 감소는 5% 내지 90% 범위이며, 사용된 고정화 방법에 의존한다. 이 단점은 고정화물의 재사용 가능성에 의해 상쇄된다. 반복 사용 중의 고정화물의 안정성 및 효소 활성을 유지하는 능력은, 산업적 규모로 고정화물을 적용하기 위한 결정적인 매개변수이다(Tanaka 및 Kawamoto, 1999). 폴리아크릴아미드 및 폴리비닐 알코올 겔이 종종 포획의 방법에 사용된다. PVA 매트릭스는 또한 섬유상 진균류로부터 단리된 β-갈락토시다제의 캡슐화에 사용됨으로써, 그 온도 안정성이 증가하였다. 효소는 50℃에서 24시간 후 그 이전 활성의 70%, 및 60℃에서 그 이전 활성의 5%를 보유하였다(Batsalova 등, 1987). Khare 및 Gupta(1988)는 두 방법, 즉 가교결합 및 폴리아크릴아미드 겔 내로의 연속적인 캡슐화의 조합을 사용하여 E. 콜라이(E.coli)으로부터의 β-갈락토시다제를 고정화하였다. 가교결합제로서 디메틸아디피미데이트 및 효소 방해 물질인 소 혈청 알부민, 시스테인 및 락토스를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 절차에서, 활성이 이전의 고정화제 활성의 190%로 측정되었다. 호열성 세균인 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터의 β-갈락토시다제 고정화의 상이한 방법들의 비교는, 가교결합 및 이에 후속되는 아가로스 과립으로의 연속적인 포획이 높은 효소 활성의 이익을 갖는 고농도의 효소의 고정화에 바람직한 공정임을 나타냈다(Berger 등, 1995). 고정화 공정은 상이한 반응 조건들 하에 효소 안정성 증가를 가능하게 한다. A. 오리자에(A. oryzae)로부터 다공성 PVA 크리오겔 내로의 β-갈락토시다제의 포획은 효소의 온도 내성, pH 값 및 이온 강도를 증가시켰다(Rossi 등, 1999). 흡착은 기술적으로 힘들지 않은 고정화 방법이다. 소수성 면 섬유가, 예를 들어 위에서 이의 이전 활성의 50%를 보존하는 효소가 그 위에 있는 담체로서 작용할 수 있다(Sharma 및 Yamazaki, 1984). Bakken 등은 축 유동 반응기 내에서, 우유 중 락토스 가수분해 과정 동안 막의 형태의 실리카겔 및 폴리비닐클로라이드 상에 A. 오리자에로부터의 β-갈락토시다제를 흡착함으로써(1990), 그 효소를 사용하였다. 뼈 분말 상에서 흡착에 의해 고정화된 β-갈락토시다제는 그 이전 활성의 83%를 보존하였으나, 4개 회분식 가수분해 과정 동안, 고정화물은 점차 그 활성을 소실하였다. 4 번째 가수분해 후, 고정화물의 활성은 본래 활성의 단지 24%였다(Carpio 등, 2000). 이 실험은 그 과정 동안에 약간의 탈착이 일어나는 고정화 방법의 단점을 나타냈다. 이 효과는 적당한 가교결합제의 첨가제 의해 제거될 수 있다(Szczodrak, 2000). Piettaa 등(1989)은 공유 결합을 사용하여 A. 오리자에로부터 단리된 β-갈락토시다제를 2개의 상이한 담체에 고정화하였다. 첫 번째는 제올라이트였으나, 이는 적은 양의 효소를 결합할 뿐이므로 편리하지 않았다. 이와 대조적으로, 분말 나일론-6은 다량의 효소를 공유적으로 결합하여, 안정적인 복합체를 생성하였다. Peters 및 Rehm(2006)은 폴리히드록시알카노에이트 과립 상에 공유 결합에 의해 β-갈락토시다제를 고정화하였다. 얻어진 고정화물은 상이한 조건들 하에서 그 저장 중에 장기 안정적이며, 이는 담체와 고정화된 효소 간의 강한 결합의 증거를 제공한다. 2개의 반응성 작용기를 갖는 글루타르디알데히드가 β-갈락토시다제 고정화에서 가장 빈번히 사용되는 가교결합제이다(Guisan 등, 1997, Szczodrak, 2000, Zhou 및 Chen 2, 2001). 그러나, 가교결합 고정화 방법은 특히 다른 방법, 예컨대 흡착 또는 포획과 조합하여 사용된다(상기 언급된 Panesar 등, 발행물). 예를 들어, 알긴산염 및 젤라틴으로부터 구성된 섬유 형태로 포획 방법을 사용하여 고정화된 A. 오리자에로부터의 β-갈락토시다제가, 이어서 글루타르알데히드에 의해 가교결합되어, 효소의 세정 제거를 방지하였다(Tanriseven 및 Dogan, 2002). 이러한 유형의 가교결합은 또한 코발트-알긴산염 겔 내로의 β-갈락토시다제 고정화에 사용되었다. 그러나, 락토스 가수분해 과정 동안 코발트 방출은 식품 산업에서 고정화물의 사용을 불가능하게 하였다(Ates 및 Mehmetoglu, 1997). 고정화 효소의 활성 및 안정성은 pH 값, 온도 및 이온 강도에 의해 영향을 받는다(Roy 및 Gupta, 2003). 유리 효소에 비해, 고정화 효소는 대부분의 공개된 연구에서 언급된 것에 비해 더 넓은 최적 pH 및 온도 범위를 갖는다. 더 낮은 pH 값 및 더 높은 온도에서 고정화 β-갈락토시다제의 더 높은 안정성은 락토스 가수분해에 유리하며, 또한 pH 값을 감소시키고 온도를 증가시킴으로써 오염의 위험이 감소한다. 반면, 최적의 pH 이동 및 안정성 증가는, 이들 조건 하에, 그 pH가 5.5 내지 6.0 구간 내에 있는 유청(sweet whey)에서 락토스 가수분해 과정 동안 유리하다(Szczodrak, 2000). 상이한 미생물 공급원으로부터의 β-갈락토시다제가 또한 연속식 작동 방식뿐만 아니라 회분식 작동 방식으로 갈락토올리고당류를 생산하기 위한 목적으로 고정화되었다(Chockchaisawasdee 등, 2005). 유리 효소에 비해, 고정화 효소는 보다 낮은 GOS 농도를 생성하였다. 이 감소는 고정화 시스템 내 효소에 대한 기질 접근의 제한에 의해 유발되었다(Mahoney, 1998). 발생하는 GOS의 농도 및 구조는 초기 기질 농도 및 효소의 기원에 상당한 정도로 의존하였다. 14%에서 23%로의 초기 락토스 농도의 증가는 GOS 생성을 2배화하였다(Foda 및 Lopez-Leiva, 2000, Chockchaisawasdee 등, 2005). Shin 등(1998)은 불레라 신굴라리스(Bullera singularis) ATCC 24193으로부터 단리한 효소를 키토잔 과립으로 고정화하였다. 이들은 이와 같이 고정화된 효소를 GOS 생성에 사용하였다. 실험은 15일 동안 지속되었으며, 그 동안 이들은 모든 당류의 GOS 55 중량%(초기 기질 농도는 100 g.ℓ-1임) 및 4.4 g/ℓ-1.h-1의 부피 생산율을 기록하였다. 올리고당류 생산에서의 고정화 β-갈락토시다제 용도의 또 다른 예가 또한 Albayrak 및 Yang(2002)의 연구에 기재되었다. 그들은 면 섬유 상에 고정화된 A. 오리자에로부터의 효소를 사용함으로써 모든 당류 중량의 26% 최대 생산(기질 농도 400 g.ℓ-1임) 및 부피 생산율 106 g.ℓ-1.h-1에 도달하였다. Foda 및 Lopez-Leiva(2000)는 GOS 제조를 위해 고정화 β-갈락토시다제를 이용하는 막 유동 반응기를 시험하였다. 그들은 20 중량%의 초기 락토스 농도로 초여과에 의해 처리된 유장을 사용함으로써 최고 생산(31 중량%)에 도달하였다. 유장은 풍부한 락토스 공급원이며, GOS 생산에서의 이의 용도는 매우 선호적인 것으로 나타난다. 고정화물의 생산에 사용되며, 렌즈 형상 형태 또는 소형 벨트로 통상적으로 제조된 생산물(폴리비닐 알코올 담체 기재의 생체촉매)인 고정화물의 생산에 사용되는 캐스팅 장치가 공지되어 있다. 폴리비닐 알코올 겔 및 바이오매스의 혼합물은 정확하고 미리 정해진 투여량으로 적하 캐스팅 메커니즘을 사용하여 연속식 컨베이어 벨트에 적용되며, 여기에서 생산 공정 동안 건조 및 물리적 겔화에 의해 접착성 덩어리로 변화한다. 현재, 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물의 생산을 위한 캐스팅 장치는, (예를 들어 폴리에틸렌으로 제조된) 연속식 컨베이어 벨트가 내부에 이동하는, 건조 채널의 전면에 배열된 캐스팅 메커니즘으로 이루어진다. 캐스팅 해드로서 공지된 캐스팅 메커니즘에는 0.1 ㎜ 내지 2.00 ㎜ 내에서 다양한 직경을 갖는 캐스팅 니들 주입기들로 된 한 열이 장착되어 있고, 이들은 상이한 주파수 및 상이한 펄스 길이를 갖는 전자석의 보조에 의해 진동하며, 연속식 컨베이어 벨트 상에서 바이오매스 및 폴리비닐 알코올의 혼합물을 전달하거나 주입한다. 캐스팅 장치는 또한 건조 채널의 상부 부분에 배치된 재팽윤 구획을 포함하는데, 이는 건조 제품을 습윤(재팽윤)시키는 저압 분무 제트의 시스템에 의해 형성된다. 또한, 캐스팅 장치에는 압력 스테인레스강 와이퍼 위에 배치되고 벨트의 구동 실린더 위의 캐스팅 장치의 운반 프레임 상에 탑재된 분무 제트에 의해 헹구어지는 스테인레스강 플레이트로 제조된 압력 와이퍼를 포함하는 수집 부분이 장착되어 있다. 주위 또는 제습 공기가 연속적 대기 제습 또는 연속 동결을 사용하여 건조 배지의 공급원으로서 사용되는데, 이는 건조 채널에 들어가기 전에 가열 소자에 의해 가온되며, 폴리비닐 알코올 담체를 기재로 하여 생산된 고정화물의 건조에 의한 겔화를 보장한다. 이러한 방식으로 배열된 캐스팅 장치는, 특히 컨베이어 벨트로부터 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물 제거의 곤란성으로 인해, 장기 경제적 생산이 불가능하다. 기계적 스테인레스강 와이퍼는 와이핑, 및 이에 이어지는 수집에 사용된다. 와이퍼는 컨베이어 벨트의 표면에 대항하여, 즉 탄성에 기초하여 견고히 압착되며, 후속하여 덩어리가 와이퍼에 의해 와이핑되어, 수집 저장소로 떨어진다. 벨트로부터 생성물의 이러한 기계적 제거는, 특히 큰 군집물, 폴리비닐 알코올 담체의 응집물, 및 낮거나 0인 활성을 갖는 생성물의 연속 생산을 고려해볼 때, 매우 미흡하였다. 추가 단점은 또한, 캐스팅 장치의 연속식 컨베이어 벨트의 상당한 기계적 마모이다. 캐스팅 장치의 재팽윤 부분 내 염 용액의 사용이 염을 연속식 벨트의 표면에 부착시키고, 결과적으로 캐스팅 장치의 컨베이어 벨트의 표면 장력에 변화를 주므로, 제품의 형상에 변화를 야기함이 또한 알게 되었다. 이 변화는, 컨베이어 벨트로부터 고정화물의 제거 및 탈착 과정 동안, 대형 클러스터 또는 응집물의 손상 및 형성이 대부분의 경우에 피할 수 없음을 의미한다.