Ｅｇ5 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 억제 방법 document_id A220623066948

유기체 내에서 세포 집단의 유지는 세포 분열 및 프로그램화된 세포 사멸의 세포 과정에 의해 조절된다. 정상 세포 내에서, 각각의 과정의 개시 및 완료와 관련된 세포 현상(event)은 고도로 조절된다. 암과 같은 증식성 질병에서, 이들 과정 중 하나 또는 둘 모두가 교란될 수 있다. 예를 들어, 암 세포는 아마도 돌연변이로 인하여 양성 조절인자가 과발현되거나 음성 조절인자가 손실되어 세포 분열 주기의 조절[체크포인트 조절(checkpoint control)]을 상실했을 수 있다. 또는, 암 세포는 음성 조절인자가 과발현되어 프로그램화된 세포 사멸이 일어나는 능력을 상실했을 수 있다. 따라서, 암 세포에 대한 체크포인트 조절 및 프로그램화된 세포 사멸의 과정을 회복시킬 새로운 화학치료 약물의 개발이 요구된다. 사람 암의 치료에 대한 하나의 접근법은 세포 주기 진행에 필수적인 단백질을 표적화하는 것이다. 세포 주기가 하나의 단계에서 다음 단계로 진행되기 위해서는, 특정한 필수 현상이 완료되어야 한다. 현상 및 단계들의 적절한 순서를 진행하는 체크포인트가 세포 주기 내에 존재한다. 한가지 이러한 체크포인트로는 유사분열의 중기 단계 동안에 일어나는 방추사 체크포인트이다. 유사분열에서 필수적인 기능을 지닌 단백질을 표적화하는 소분자가 방추사 체크포인트를 개시하여 유사분열중인 세포를 정지(arrest)시킬 수 있다. 유사분열중인 세포를 정지시키는 소분자 중에서, 임상에서 항-종양 활성을 나타내는 것들은 또한 프로그램화된 세포 사멸과 관련된 형태학적 변화인 아폽토시스(apoptosis)를 유발한다. 따라서, 암 치료에 효과적인 화학치료제는 체크포인트 조절 및 프로그램화된 세포 사멸을 유발하는 것일 수 있다. 불행하게도, 세포 내에서 이러한 과정들을 조절하는데 이용가능한 화합물이 거의 없다. 유사분열 정지 및 아폽토시스를 유발하는 것으로 공지된 대부분의 화합물은 튜불린 결합제로서 작용한다. 이들 화합물은 미세소관의 역학적 불안정성을 변경시키고 유사분열 방추사의 기능/구조를 간접적으로 변경시킴으로써 유사분열 정지를 일으킨다. 이들 화합물 대부분은 모든 미세소관의 성분인 튜불린 단백질을 특이적으로 표적화하므로, 이들은 미세소관이 역할을 담당하는 다수의 정상적인 세포 과정 중 하나 이상에 영향을 미칠 수도 있다. 따라서, 증식 세포와 관련된 표적 단백질을 보다 특이적으로 표적화하는 소분자도 요구된다. Eg5는 유사분열 방추사에 위치하고, 양극성 유사분열 방추사의 형성 및/또는 기능에 필요한 것으로 알려진 다수의 키네신-유사 운동 단백질 중 하나이다. 최근에, 유사분열 방추사의 양극성을 교란시키는 소분자가 보고되었다[참조: 본원에 참조로 인용된 Mayer, T, U. et. al. 1999. Science 286(5441) 971-4]. 보다 구체적으로, 당해 소분자는 비정상적인 유사분열 방추사의 형성을 유발시켰는데, 즉 미세소관의 모노아스트럴 배열(monoastral array)이 중심체의 중심 쌍으로부터 방사되고, 염색체가 미세소관의 원위 말단에 부착되었다. 당해 소분자는 모노아스트럴 배열에 따라 "모나스트롤(monastrol)"이라고 명명되었다. 이러한 모노아스트럴 배열 표현형은 Eg5 운동 단백질이 면역고갈된 유사분열 세포에서 이미 관측되었다. 이러한 특별한 모노아스트럴 배열 표현형은 Eg5의 잠재적 억제제로서의 모나스트롤의 확인을 용이하게 하였다. 게다가, 모나스트롤은 또한 시험관내 검정에서 미세소관의 Eg5 운동 단백질에 의한 운동성을 억제시키는 것으로 밝혀졌다. Eg5 억제제 모나스트롤은 세포 내에서 관련 키네신 모터에 대해 또는 골지체 운동에 관여하는 모터(들)에 대해 분명한 영향을 미치지 않았다. Eg5의 면역고갈 또는 Eg5의 모나스트롤 억제를 통해 모노아스트럴 배열 표현형을 나타내는 세포는 세포 주기의 M 단계에서 정지한다. 그러나, Eg5의 면역고갈 또는 억제에 의해 유도된 유사분열 정지는 일시적이다[참조: Kapoor, T. M., 2000, J Cell Biol 150(5) 975-80]. 모나스트롤에 의해 유도된 모노아스트럴 배열 표현형 및 유사분열에서의 세포 주기 정지 둘 모두는 가역적이다. 세포는 회복되어 정상적인 양극성 유사분열 방추사를 형성하고, 유사분열을 완료하여 세포 주기 및 정상적인 세포 증식이 진행된다. 이러한 데이터는, 일시적인 유사분열 정지를 유도하는 Eg5의 소분자 억제제가 암세포 증식의 치료에 효과적이지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 모나스트롤이 유사분열 정지를 일으킨다는 발견은 흥미로우며, 따라서 사람 암의 치료에 효과적인 방식으로 Eg5 운동 단백질을 조절하는데 사용될 수 있는 화합물을 추가로 연구하고 확인할 필요가 있다. 이들 화합물을 다른 항신생물제와 함께 사용하는 것을 조사할 필요도 있다. VEGF(혈관 투과성 인자, VPF로도 공지되어 있음)는 혈관신생(angiogenesis), 상피 세포 증식 및 내피 세포 생존을 자극하는 다기능성 사이토카인이다. VEGF는 매우 다양한 조직에 의해 생산될 수 있고, 이의 과발현 또는 비정상적인 발현은 암을 포함하는 각종 질환 및 노화 관련 황반 변성과 같은 망막 질환 및 기타 혈관신생 질환을 일으킬 수 있다. 최근에, 이본쇄 RNA 분자(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 고도로 보존된 조절 기전에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 국제공개공보 제WO 99/32619호(Fire et al.)에는 길이가 25개 뉴클레오타이드 이상인 dsRNA를 사용하여 씨.엘레간스(C. elegans)에서 유전자의 발현을 억제하는 것이 기술되어 있다. dsRNA는 식물[참조: 국제공개공보 제WO 99/53050호, Waterhouse et al.; 및 제WO 99/61631호, Heifetz et al.), 드로소필라(Drosophila)[참조: Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), 및 포유동물[참조: 국제공개공보 제WO 00/44895호, Limmer; 및 독일특허출원 제DE 101 00 586.5호, Kreutzer et al.)을 포함하는 다른 유기체에서 표적 RNA를 분해시키는 것으로도 밝혀졌다. 현재 이러한 천연 기전은 비정상적이거나 원하지 않는 유전자 조절에 의해 발생하는 질환을 치료하기 위한 새로운 계열의 약제를 개발하는데 있어서 집중을 받게 되었다. RNAi 분야에서의 현저한 발전과 Eg5 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에 있어서의 발전에도 불구하고, 높은 생물학적 활성과 생체내 안정성 둘 모두를 갖는 세포 자체의 RNAi 기구를 사용하여 Eg5 유전자를 선택적으로 그리고 효과적으로 사일런싱(silencing)시킬 수 있고, Eg5 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정을 치료하는데 사용하기 위하여 표적 Eg5 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 제제가 여전히 요구된다. 발명의 개요 본 발명은 이본쇄 리보핵산(dsRNA), 및 이러한 dsRNA를 단독으로 또는 VEGF를 표적화하는 dsRNA와 함께 사용하여 세포 또는 포유동물에서 Eg5 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 암에서와 같이, Eg5 유전자의 발현에 의해 발생하는 병리학적 상태 및 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 dsRNA는, 길이가 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 길이가 19 내지 24개 뉴클레오타이드이고 Eg5 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 갖는 RNA 쇄(안티센스(antisense) 쇄)를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 Eg5 유전자의 발현을 억제하기 위한 이본쇄 리보핵산(dsRNA)을 제공한다. dsRNA는 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함한다. dsRNA는 제1 서열을 포함하는 센스 쇄 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 쇄를 포함한다. 안티센스 쇄는 Eg5를 암호화하는 mRNA의 적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상보성 영역의 길이는 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로는 19 내지 24개 뉴클레오타이드이다. dsRNA를 Eg5를 발현하는 세포와 접촉시키면, Eg5 유전자의 발현이 40% 이상 억제된다. 예를 들어, 본 발명의 dsRNA 분자는 표 1 내지 3의 센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 dsRNA의 제1 서열 및 표 1 내지 3의 안티센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 dsRNA 분자는 천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 또는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트 그룹을 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오타이드와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또는, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 고정된(locked) 뉴클레오타이드, 무염기(abasic) 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트 및 비-천연 염기 포함 뉴클레오타이드의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 이러한 변형된 서열은 표 1 내지 3의 센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 dsRNA의 제1 서열 및 표 1 내지 3의 안티센스 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 서열에 기초할 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 중 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 당해 세포는 일반적으로 사람 세포와 같은 포유동물 세포이다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 dsRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 전달 비히클을 포함하는, 유기체, 일반적으로 사람 피험자에서 Eg5 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함하는 이본쇄 리보핵산(dsRNA)을 세포 속으로 도입시키는 단계 [여기서, 상기 dsRNA는 제1 서열을 포함하는 센스 쇄 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 쇄를 포함한다. 상기 안티센스 쇄는 Eg5를 암호화하는 mRNA의 적어도 한 부분에 대해 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역의 길이는 30개 뉴클레오타이드 미만, 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오타이드이며, 상기 dsRNA를 Eg5를 발현하는 세포와 접촉시키면 Eg5 유전자의 발현이 40% 이상 억제된다]; 및 (b) 단계 (a)에서 생성된 세포를 Eg5 유전자의 mRNA 전사체가 분해되는데 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포 내에서 Eg5 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하여, 세포 내에서 Eg5 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 Eg5 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료, 예방 또는 관리를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 하나 이상의 dsRNA의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 투여함을 포함하여, Eg5 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정, 예를 들면, 암을 치료하거나, 예방하거나, 관리하는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나의 dsRNA의 하나 이상의 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 세포 내에서 Eg5 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 세포 내에서 Eg5 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 당해 벡터는 본 발명의 하나의 dsRNA의 하나 이상의 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 Eg5 dsRNA, 및 VEGF mRNA를 표적화하는 제2의 dsRNA와 함께 사용되는 상기 Eg5 dsRNA의 상기한 바와 같은 용도를 제공한다. Eg5를 표적화하는 dsRNA 및 VEGF를 표적화하는 제2의 dsRNA의 배합물은 과증식성 질환, 특히 간암종을 치료하기 위한 상응하고 상승작용적인 활성을 제공한다.