ＡＮＴＩ-ＭＩＲＮＡ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물 document_id A220623067054

마이크로 RNA- 유전자 발현의 신규 조절자 마이크로 RNA (miRNA)는 표적 mRNA와 염기쌍을 이룸으로써 유전자 발현의 전사후 조절자로서 작용하는, 풍부한 부류의 짧은 내인성 RNA이다. 성숙한 (mature) miRNA는 RNase III 리보뉴클레아제 Drosha (Lee et al. 2003) 및 Dicer (Hutvagner et al. 2001, Ketting et al. 2001)에 의해 더욱 긴 헤어핀 전사체로부터 순차적으로 가공된다. 2005년 10월 현재 miRBase microRNA database release 7.1에 따르면, 척추동물, 무척추 동물 및 식물에서 3400개 이상의 miRNA에 대한 해석이 이루어졌고 (Griffith-Jones 2004, Griffith-Jones et al. 2006), 추정되는 유전자에 상응하는 다수의 miRNA도 동정된 바 있다. 대부분의 동물 miRNA는 불완전한 염기쌍 결합에 의해 3'-UTR에 위치한 이들의 표적 부위를 인식하여, 표적 유전자의 해독 억제를 유발한다 (Bartel 2004). 늘어나고 있는 연구 결과, 동물 miRNA가 세포 생장 및 세포 사멸 (Brennecke et al. 2003), 조혈세포주 분화 (Chen et al. 2004), 생명 연장 조절 (Boehm and Slack 2005), 광수용체 분화 (Li and Carthew 2005), 호메오박스 유전자 조절 (Yekta et al. 2004, Hornstein et al. 2005), 신경 비대칭 (Johnston et al. 2004), 인슐린 분비 (Poy et al. 2004), 뇌 형태발생 (Giraldez et al. 2005), 근육 증식 및 분화 (Chen, Mandel et al. 2005, Kwon et al. 2005, Sokol and Ambros 2005), 심장발생 (Zhao et al. 2005) 및 척추 동물에서의 후기 배 발생 (Wienholds et al. 2005)에서 기초적인 생물학적 기능을 수행하고 있음이 나타나 있다. 인간 질병에서의 마이크로 RNA miRNA는 여러 가지의 인간 질병에 관여한다. 그 중 하나로 척수 근육 위축증 (SMA), 즉 운동 뉴런 생존 (SMN) 유전자의 감소된 단백질 수준 또는 기능 손실 돌연변이에 의해 유발된 소아 신경퇴화 질환이 있다 (Paushkin et al. 2002). 인간 SLITRK1 유전자에서 miR-189의 표적 부위에서의 돌연변이는 최근에 투어렛 증후군 (Tourette's syndrome)과 관련이 있는 것으로 드러났는데 (Abelson et al. 2005), 또 다른 최근의 연구에 의하면 C형 간염 바이러스 (HCV) RNA 게놈이 숙주 세포 마이크로 RNA인 간 특이적인 miR-122a와 상호작용하여서, 숙주에서 이의 복제를 촉진한다는 것이 보고된 바 있다 (Jopling et al. 2005). miRNA나 이들의 프로세싱 기작이 관련되어 있는 다른 질병에는, 프래자일 X 정신 지체 단백질 (FMRP)의 부재에 의해 유발되는 프래자일 X 정신 지체 (FXMR) (Nelson et al. 2003, Jin et al. 2004)와, DiGeorge 증후군 (Landthaler et al. 2004)이 있다. 그 밖에도, 불안정한 miRNA 발현 패턴이 다수의 인간 암에서 보고된 바 있다. 예를 들어, 인간 miRNA 유전자 miR15a 및 miR16-1은 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 사례의 대부분의 B 세포에서 결실되거나 하향 조절되는데, 여기에서 13 miRNA 유전자의 독특한 표식이 예후 및 진행과 관련되어 있다는 것이 최근에 밝혀졌다 (Calin et al. 2002, Calin et al. 2005). 암에서 miRNA의 역할은, 인간 miRNA 유전자의 50% 이상이 암 관련 게놈 부위 또는 프래자일 부위에 위치하고 있다는 사실에 의해서 추가로 뒷받침된다 (Calin et al. 2004). 최근, 다양한 인간 암의 전신 발현 분석 결과, 정상 조직에 비해서 암 조직에서 miRNA가 일반적으로 하향조절된다는 것이 밝혀졌다 (Lu et al. 2005). 분화가 잘 이루어지지 않은 암을 miRNA를 기준으로 분류한 것이 성공적이었던 반면에, 동일한 시료에 적용하였을 때 mRNA 프로파일은 매우 부정확했다는 점이 매우 흥미롭다. miRNA는 또한 유방암 (Iorio et al. 2005), 폐암 (Johnson et al. 2005) 및 결장암 (Michael et al. 2004)에서 하향조절되는 것으로 밝혀진 바 있지만, 인간 B-세포 림프구에서 증폭되는 miR-17-92 클러스터와 버킷 림프구에서 상향조절되는 miR-155은 인간의 첫번째 miRNA 온코진 (oncogene)으로서 보고된 바 있다 (Eis et al. 2005, He et al. 2005). 그러므로, 인간 miRNA는 미래의 암 진단을 위한 생물학적 마커로서 유용할 뿐만 아니라, 올리고뉴클레오타이드 기술을 통한 질병의 치료적 매개체로서 매력적인 표적으로서 최근에 대두되고 있는 실정이다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 마이크로RNA를 억제 miRNA를 억제하기 위한 방법으로서 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 몇 가지 방법이 아래와 같이 보고된 바 있다. WO03/029459 (Tuschl)은 뉴클레오타이드 유사체를 함유할 수 있는 18 내지 25 뉴클레오타이드 길이의 마이크로 RNA 및 이의 상보체를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 청구하고 있다. LNA가 가능한 뉴클레오타이드 유사체로서 제안되고 있기는 하나, LNA를 함유하지 않는 올리고뉴클레오타이드도 기재되어 있다. Tuschl은 miRNA 올리고뉴클레오타이드가 치료에서 사용될 수 있음을 서술하고 있다. US2005/0182005는 miR 21 유발된 억제를 감소시키는 것으로 밝혀진 miR21의 가장 긴 형태에 상보적인, 24mer 2'OMe RNA 올리고리보뉴클레오타이드를 서술하고 있는 반면에, 이와 등가물인 DNA 함유 올리고뉴클레오타이드에 대해서는 서술하고 있지 않다. 2'OMe-RNA라는 용어는 RNA 유사체를 언급하는 것으로서, 2' 위치에서의 메틸기 (2'O메틸기)에서 치환이 일어난 RNA 유사체를 말한다. US2005/0227934 (Tuschl)는 50% 이하의 DNA 잔기를 함유하는 antimir 분자를 언급하고 있다. 이 문헌은 또한 2'OMe RNA를 함유하는 antimir는 췌장 마이크로 RNA에 대해 사용되었다고 보고한 바 있지만, 실질적인 올리고뉴클레오타이드 구조는 언급되어 있지 않은 것으로 보인다. US20050261218 (ISIS)는 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 올리고머 화합물을 청구하고 있는데, 상기 화합물에서 적어도 하나의 영역은 변형을 포함하고, 올리고머 화합물의 일부는 소형의 비코딩 RNA 표적 핵산으로 표적화되는데, 여기에서 소형의 비코딩 RNA 표적 핵산은 miRNA이다. 길이가 17 내지 25 뉴클레오타이드 사이인 올리고머 화합물이 청구되어 있다. 실시예에서는 2'OMe PS 화합물 전체 즉 21mer 및 20mer를 언급하고 있으며, 프리-miRNA 및 성숙한 miRNA 표적의 범위에 대해 2'OMe 갭머 (gapmer) 올리고뉴클레오타이드가 표적화된다. Boutla et al. 2003 (Nucleic Acids Research 31: 4973-4980)은 드로소필라 (Drosophila)에서 11개의 상이한 miRNA에 상보적인 DNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도 뿐만 아니라, 파리 배아로 DNA 올리고뉴클레오타이드를 주사함으로써 miRNA를 불활성화시키는 용도도 기재한 바 있다. 11개의 DNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중에서도 단 4개의 작제물만이 정상적인 발생을 심하게 방해하였던 반면, 남은 7개의 올리고뉴클레오타이드는 예상된 표현형을 나타내지 않았는데, 이는 아마도 해당 miRNA를 억제하는 데 있어 불활성이기 때문일 것으로 예상된다. 이에 대한 별법으로서 Hutvagner et al. (2004) 및 Leaman et al. (2005)이 보고한 바에 따르면, 시험관내 및 드로소필라 (Drosophila) 및 씨. 엘레간스 (C. elegans) 생체내에서 쇼트 인터퍼링 RNA (siRNA) 및 miRNA 기능의 잠재적이고 불가역적인 억제자로서 성숙한 miRNA에 대해 상보적인 2'-O-메틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 기능이 소실된 표현형을 유발할 수 있다고 한다. 이 방법의 단점은 형질감염 및 주사 실험에서 높은 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드 농도 (100 마이크로몰)가 필요하다는 것인데, 이 농도는 동물에 독성일 수 있다. 이 방법은 최근에 생체내에서 miRNA를 사일런싱 (silencing)하기 위해 콜레스테롤을, 4가지 상이한 miRNA에 상보적인 2'-O-메틸 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 컨쥬게이팅시킴으로써 마우스 연구에 적용하였다 (Kruzfedt et al. 2005). 이와 같은 소위 antagomir는 정맥내 주사로 마우스에게 투여된다. 이러한 실험은 생체내에서 내인성 miRNA의 특이적이고 효율적이며 장기간 지속되는, 효과적인 사일런싱을 유발하는 것으로 밝혀졌으나, 이에 대한 단점은 효과적인 사일런싱을 위해서는 2'-O-Me antagomir가 고용량으로 (80 mg/kg) 필요하다는 것이었다. LNA로 변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 마이크로 RNA를 억제하는 것이, Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14) 6029-6033, Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560, Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8 (3), 278-84 및 Orum et al. Gene 2006, (Available online 24 February 2006)에 이미 서술된 바 있다. 모든 경우 LNA로 변형된 anti-mir 올리고뉴클레오타이드는 전체적인 성숙한 마이크로RNA에 상보적이었는데, 즉 20 내지 23 길이었으며, 이는 생체내에서 효율적인 흡수를 방해하고, 분자가 생체내에 널리 분포되는 것을 방해한다. Naguibneva (Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8은, 시험관내에서 마이크로RNA miR-181 기능을 억제하기 위하여 mixmer DNA-LNA-DNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 anti-mir을 사용하는 것을 기재하고 있는데, 이 때 8 LNA 뉴클레오타이드의 블록은 5' 말단에서 6 DNA 뉴클레오타이드에 의해, 3' 말단에서 9 DNA 뉴클레오타이드에 의해 각각 플랭킹된 (flanked) 분자의 중심에 위치한다. 이 안티센스 디자인의 주요 단점은 플랭킹 DNA 말단의 낮은 뉴클레아제 내성 때문에 생체내에서 안정성이 낮다는 것이다. Chan et al. (Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14) 6029-6033) 및 Orum et al. (Orum et al. Gene 2006, (Available online 24 February 2006)은 그들의 연구에 사용된 LNA로 변형된 anti-mir 분자의 디자인을 기재하지는 않았지만, Lecellier et al. (Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560)은 마이크로RNA 기능을 억제하기 위한 갭머 LNA-DNA-LNA 안티센스 올리고뉴클레오타이드 anti-mir을 사용하는 것을 기재하고 있는데, 여기에서 4 LNA 뉴클레오타이드의 블록은 각각 5' 말단과 3' 말단에 위치하고 있으며, 이때 분자의 중심에는 13 DNA 뉴클레오타이드의 창 (window)이 존재한다. 이 안티센스 디자인의 주요 결점은 생체내 흡수성이 낮다는 점과, anti-mir 올리고뉴클레오타이드에서의 13 뉴클레오타이드 DNA 스트레치 (stretch) 때문에 생체내 안정성이 낮다는 점이다. 그러므로, 이 분야에서는 마이크로 RNA를 억제할 수 있는 개선된 올리고뉴클레오타이드가 요구되는 실정이다. 발명의 개요 본 발명은 miRNA 표적에 높은 친화도로 결합하게 디자인되는 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하면 생체내에서 마이크로 RNA에 의한 mRNA의 억제를 매우 효율적으로 완화시킨다는 발견에 근거한다. 임의의 특정한 이론으로 구속할 의도는 없지만, 본원에 설명된 증거들은, 생체내에서 miRNA를 고효율로 표적화하는 것은 생체내에서 miRNA 표적과 매우 안정한 듀플렉스를 형성할 것을 목표로 하여 올리고뉴클레오타이드를 디자인함으로써 달성된다는 것을 설명해 주고 있다. 이는, 짧은, 예컨대 10-17 또는 10-16 뉴클레오염기 올리고뉴클레오타이드와 같이 짧은, 적어도 하나의 LNA 유닛과, 적당하게는 LNA, 2'-플루오로 뉴클레오타이드 유사체의 2'-MOE RNA와 같은 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 사용함으로써 달성된다. 하나의 측면에서, 목적은 siRNA 복합체 (즉, 짧은 올리고뉴클레오타이드)를 형성하지 않는 길이의 올리고뉴클레오타이드를, 이의 miRNA 표적, 효과적으로는 miRNA 표적과 안정하고 비기능적인 듀플렉스를 효율적으로 형성하는 표적과 거의 영구적으로 결합하는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 충분하게 로딩하면서 발생시키는 것이다. 본 발명자들은 이러한 디자인은 선행 기술의 올리고뉴클레오타이드, 특히 갭머 (gapmer) 및 블록머 (blockmer) 디자인과, 20mer 내지 23mer와 같은, 길이가 긴 올리고뉴클레오타이드보다는 상당히 더 효율적이라는 것을 발견하였다. 용어 2'플루오르-DNA라는 용어는 2' 위치에 불소가 치환된 (2'F) DNA 유사체를 말한다. 본 발명은 길이가 8 내지 17, 예를 들어 10 내지 17, 8 내지 16, 또는 10 내지 16 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오염기 유닛 중 적어도 하나는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 잠금 핵산 (Locked Nucleic Acid; LNA) 뉴클레오염기 유닛이고, 여기에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 인간 마이크로RNA miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 및 miR-375로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 마이크로RNA 서열에 상보적인 것이다. 본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'acgttt5'(SEQ ID NO 6, 5'tttgca3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다. 본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'ctcaca5'(SEQ ID NO 7, 5'acactc3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다. 본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'ttacga5'(SEQ ID NO 8, 5'agcatt3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다. 본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'acaagc5'(SEQ ID NO 9, 5'cgaaca3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 중에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다. 본 발명은 길이가 10 내지 26 뉴클레오염기 유닛인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 면역 보조제를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 올리고뉴클레오타이드는 3'말단으로부터 계수하여 2 내지 7 또는 3 내지 8번 위치에 3'cgaata5'(SEQ ID NO 10, 5'ataagc3')의 코어 DNA 서열을 포함하고, 여기에서, 상기 서열 내에 적어도 하나의, 예컨대 1개, 좋기로는 적어도 2개, 예컨대 2개 또는 3개의 DNA 유닛은 이들의 해당 LNA 유닛으로 치환된 것이고, 임의로는 상기 올리고뉴클레오타이드는 7개 이상의 연속적인 DNA 유닛으로 구성된 영역을 포함하지 않는다. 고친화성 뉴클레오타이드 유사체는 등가물 DNA 뉴클레오타이드의 결합 친화성보다 상보적인 RNA 뉴클레오타이드와의 더 높은 듀플렉스 열 안정성을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 초래하는 뉴클레오타이드 유사체이다. 이는 통상 Tm을 측정함으로써 결정된다. 본 발명자들은 특이적인 miRNA에 대해 표적화된 짧고 고친화성인 올리고뉴클레오타이드를 사용할 경우 이렇다 할 유의적인 오프-타겟 효과 (off-target effects)를 확인하지 못하였다. 결국, 본원에 제공된 증거들은 mRNA 발현에 대한 효과들은, mRNA내에서 표적화된 miRNA에 상보적인 서열의 존재 (1차 mRNA 표적)나, 1차 mRNA 표적에 의해 조절되는 mRNA에 대한 2차 효과의 존재 (2차 mRNA 표적) 때문이라는 것을 가리키고 있다. 독성 효과는 확인되지 않았는데, 이는 유의적으로 유해한 오프-타겟 효과가 존재하지 않음을 가리킨다. 본 발명은 또한, 예컨대 약학적 조성물의 일부를 구성할 수 있는 것과 같은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의, 마이크로RNA의 존재나 과다 발현 (상향 조절)의 존재와 관련된 질병이나 의학적 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명은 또한, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 존재나 과다발현과 관련된 질병이나 의학적 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 약학적 조성물) 또는 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA 유효량을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 이 맥락에서 유효량을 감소시킨다는 것은, 세포 또는 유기체에 존재하는 기능적인 miRNA를 감소시킴을 말하는 것이다. 본 발명에 따른 양호한 올리고뉴클레오타이드는, 일반적으로 이들이 그의 miRNA 표적과 매우 안정적인 듀플렉스를 형성하기 때문에, 세포 또는 유기체 중에서 miRNA의 실제 양을 항상 유의적으로 감소시키는 것은 아닌 것으로 나타났다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 약학적 조성물) 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 유기체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제 (de-repression)시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 마이크로RNA의 존재나 과다발현과 관련된 질병 또는 의학적 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 8 내지 16, 예컨대 8 내지 16이나 10 내지 16 뉴클레오염기 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한, 치료를 필요로 하는 환자에게 길이가 8 내지 16, 예컨대 10 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 마이크로RNA의 존재나 과다 발현과 관련된 질병이나 의학적 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 세포 또는 유기체에 8 내지 16, 예컨대 10 내지 16 뉴클레오염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 (예컨대 약학적 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA 표적의 유효량 (즉, 표적 mRNA를 억제할 수 있는데 사용 가능한 miRNA의 양)을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 세포 또는 유기체에 8 내지 16, 예컨대 10 내지 16 뉴클레오염기로 된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 (또는 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 세포 또는 유기체에서 miRNA의 표적 mRNA를 탈억제시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, a. 3'말단으로부터 계수하여, LNA 뉴클레오염기와 같은 뉴클레오타이드 유사체인 첫번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계; b. 3'말단으로부터 계수하여, LNA 뉴클레오염기와 같은 뉴클레오타이드 유사체인 두번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계; c. 전술한 바와 같은 miRNA 씨드 영역 (seed region)에 해당하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 영역을 선택하는 단계; d. 전술한 바와 같은 7번째 및 8번째 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계; e. 뉴클레오타이드 (x) 및 뉴클레오타이드 유사체 (X), 예컨대 LNA로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 1 내지 10개의 추가의 뉴클레오염기를 선택하는 임의적 단계; f. 전술한 바와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 영역을 선택하는 임의적 단계; g. 전술한 바와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 선택하는 임의적 단계를 포함하는, 본원에서 서술된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 같은, 인간 마이크로-RNA, miR19b, miR-21, miR-122A, miR-155 및 miR-375로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 마이크로RNA에 대해 표적화된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법을 제공하는데, 여기에서 합성은 a - g 단계에서 정의된 영역을 순차적으로 합성함으로써 수행하고, 여기에서 합성은 3'에서 5'방향(a에서 g) 또는 5'에서 3'방향(g에서 a) 방향 중 어느 하나로 수행될 수 있고, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 표적의 서열에 상보적이다. 하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 표적이 RISC에 의해 리쿠르트되지 (recruited) 않거나, RISC 지향적 절단을 매개하지 않도록 디자인된다. 긴 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면 21mer 또는 22mer, 특히 miRNA 표적에 상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA "유사체"인 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써, 올리고뉴클레오타이드는 RISC 복합체 결합의 측면에서 표적 mRNA와 경쟁할 수 있고, 이로써 miRNA에 대한 기질로서 경쟁하는 올리고뉴클레오타이드의 도입에 의해서 miRNA 표적 mRNA의 miRNA 억제를 완화할 수 있는 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명은 상보적일 수 있고 명백히는 일부 경우에 거의 불가역적으로 성숙한 마이크로RNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 제공함으로써, 이러한 바람직하지 않은 표적 mRNA 절단이나 해독 억제를 방지하는 방안을 탐색한다. 이는 분해나 절단 (예를 들어, RISC 또는 RNAseH 또는 기타의 엔도 또는 엑소 뉴클레아제)에 대해서 보호하는 형태를 초래할 수 있고, 이는 세포내에 miRNA의 실질적이거나 더욱 상당한 감소 (예를 들어, LNA 프로브를 사용하여 노던 블롯에 의해 검출될 수 있는 정도의)를 초래하지 않을 수 있는 것으로 보이나, 탈억제 분석에 의해 측정한 바에 따르면 유효량의 miRNA는 상당히 감소된다는 것을 보장한다. 그러므로, 하나의 측면에서, 본 발명은 RISC 복합체와 함께 사용가능하지 않되, 올리고뉴클레오타이드에 의해 적정 (titration)함에 의해서 miRNA를 제거하도록 디자인될 것이 제안되는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 특정한 이론으로 구속시킬 의도는 없지만, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 유사한 RNA계 올리고뉴클레오타이드 (또는 완전한 2'OMe 올리고뉴클레오타이드)에 비해 매우 효과적인 이유는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드가 세포질로부터 사용가능한 miRNA를 효과적으로 제거하기 때문에 miRNA 기능의 비경쟁적 억제를 통해 작동하는 반면에, 선행 기술의 올리고뉴클레오타이드는 경쟁적 억제자로서 작용할 수 있는 대안적인 miRNA 기질을 제공하며, 그 효율은 세포질 내의 올리고뉴클레오타이드의 농도에 더욱 의존할 뿐만 아니라, 표적 mRNA 및 miRNA의 농도에도 의존하기 때문인 것으로 보인다. 특정한 이론으로 구속시킬 의도는 없지만, miRNA 표적 (즉, miRNA)과 대략 유사한 길이로 구성된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것으로 인해 존재할 수 있는 또 하나의 가능성은, 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 표적과 siRNA 라이크 듀플렉스 (siRNA like duplex)를 형성할 수 있다는 것인데, 이러한 상황에 의해 올리고뉴클레오타이드의 효율은 감소될 것이다. 또한, 올리고뉴클레오타이드 자체가 RISC 복합체 내에서 가이드 (guide) 가닥으로서 사용되는 가능성도 존재하는데, 이에 의해 올리고뉴클레오타이드 가이드에 충분히 상보적인 것으로 된, 비특이적인 표적의 RISC 지향성 분해의 가능성이 발생한다. miRNA 서열을 표적화하기 위한 짧은 올리고뉴클레오타이드를 선택함으로써, 이러한 문제점은 회피된다. LNA를 통합시킨 짧은 올리고뉴클레오타이드는 반응 시약 분야에서 알려져 있는데, 예컨대 LNA가 있다 (참조 예를 들어, WO2005/098029 및 W0 2006/069584). 그러나, 진단용 또는 시약용으로 디자인된 분자는 이의 약학적 용도에 따라 디자인 면에서 매우 상이하다. 예를 들어, 시약인 올리고뉴클레오타이드의 말단 뉴클레오염기는 전형적으로는 LNA가 아니고 DNA이며, 사이에 낀 뉴클레오사이드 결합은 보통, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에서 사용하기 위한 양호한 결합인 포스포로티오에이트 이외의 것이다. 그러므로 본 발명은 신규 부류의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 측면에서 서술된 바와 같은 (단일 가닥) 올리고뉴클레오타이드를 제공하는데, 여기에서 상기 올리고뉴클레오타이드는 하기 중 어느 하나를 포함한다: i) 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합 및/또는 ii) 적어도 하나의 3'말단 LNA 유닛, 및/또는 iii) 적어도 하나의 5' 말단 LNA 유닛. 대부분의 치료 용도를 위해서는, 올리고뉴클레오타이드가 완전히 포스포로티오에이트화되는 것이 좋으나, 단, 뇌나 척수와 같은 CNS에서 사용하기 위한 치료용 올리고뉴클레오타이드는 제외하는데, 이 곳에서는 포스포로티오에이트화가 독성을 유발할 수 있고, 또한 뉴클레아제가 없기 때문에 연속적인 DNA 유닛 간에도 포스포다이에스테르 결합이 사용될 수 있기 때문이다. 본원에 언급된 바와 같이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 다른 양호한 측면에서는 (3' 말단으로부터) 2번째 3'뉴클레오베이스 및/또는 9번째 및 10번째는 LNA일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 RNA 절단 (예컨대 혈청 중의 엑소 뉴클레아제 분해 등), 또는 RISC 관련 절단을 피하기 위한 다른 방법도 가능함을 발견하였는데, 이와 같이 본 발명은 하기 중의 하나를 포함하는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다: a. 3' 말단으로부터 계수하여 1 및 2번 위치에 있는 LNA 유닛 및/또는 b. 3' 말단으로부터 계수하여 9 및/또는 10번 위치에 있는 LNA 유닛 및/또는 c. 1개 또는 2개의 5' LNA 유닛 중 어느 하나. 이러한 다른 측면의 이점은 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 예를 들어 길이가 26 이하의 뉴클레오염기인 뉴클레오타이드를 사용하여 나타날 수 있는 것이지만, 이러한 특징은 본원에 서술된 더욱 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 즉 예를 들면 8 내지 17, 8 내지 16, 10 내지 17 또는 10 내지 16의 뉴클레오염기 사이의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여서 나타날 수도 있는 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 본원에서 서술된 것과 같은 것들을 포함하는 것이 좋지만, LNA 유닛을 포함하는 것이 가장 좋다. 이에 따라 본 발명자는, 특정한 순서로 잠금 핵산 (LNA) 유닛을 포함하는, 신중하게 디자인된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 마이크로 RNA를 상당히 사일런싱시켜서, 결국은 감소된 마이크로RNA 수준을 초래한다는 것을 의외로 발견하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드가 소위 씨드 서열인, 표적 마이크로 RNA의 5' 말단으로부터 계수하여 2 내지 8, 또는 2 내지 7번째 뉴클레오타이드에 단단히 결합하는 것이 중요하다는 것을 발견하였다. 표적 마이크로 RNA의 뉴클레오타이드 1은 쌍을 이루지 않는 염기이고, Ago 2 단백질 중의 결합 주머니 속에 거의 대부분은 감추어져 있다. 본 발명의 발명자들은 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 갖는 씨드 영역 서열 (바람직하게는, 상기 LNA는 상기 씨드 영역에 상보적인 영역의 LNA 유닛인 것이 좋다)을 선택하면, miRNA 및 올리고뉴클레오타이드 간의 듀플렉스가 특히 miRNA를 표적화하는데 효과적이어서, 오프-타겟 효과를 피하고 또한 가능하게는 RISC 지향적 miRNA 기능을 방지하는 추가의 특징을 제공하기도 한다고 생각하고 있으나, 어떤 특정한 이론에 구애되는 것은 아니다. 본 발명자는, 마이크로RNA 사일런싱은 LNA로 변형된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 쌍을 이루지 않는 뉴클레오타이드 1에 해당하는 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드를 함유하지 않을 때 더욱 더 향상된다는 것을 의외로 발견한 바 있다. 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 3'말단에 있는 2개의 LNA 유닛은 상기 올리고뉴클레오타이드로 하여금, 뉴클레아제에 대해서 더 내성을 띠도록 만들어 준다는 것 또한 발견하였다. 또한, 표적 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 계수하여 10 및 11번 위치에 해당하는 위치에서 LNA 뉴클레오타이드와 같은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 절단을 예방할 수 있음을 추가로 발견하였다. 이에 따라, 본 발명의 하나의 측면은 길이가 12 내지 26 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드에 관한 것으로서, 여기에서 i) 3' 말단에서 계수하여 첫번째 뉴클레오타이드는 잠금 핵산 (LNA) 유닛이고, ii) 3' 말단에서 계수하여 두번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛이고, iii) 3' 말단에서 계수하여 9번째 및/또는 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛이다. 본 발명은 또한, 약제로서 사용하기 위한 본원에 서술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 또한, 본원에 서술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 위에도 설명한 바와 같이, 마이크로 RNA는 다수의 질병과 관련되어 있다. 그러므로, 본 발명의 네번째 측면은, 척수 근육 위측증, 투어렛 증후군, C형 간염, 프래자일 X 정신 지체, DiGerge 증후군 및 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 폐암 및 결장암과 같은 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 마이크로 RNA의 발현과 관련된 질병의 치료용 약제, 구체적으로 암치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에서 서술되어 있는 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 하나의 측면은, 본원에 정의되어 있는 바와 같은 올리고뉴클레오타이드에 표적 마이크로RNA를 접촉시킴으로써 표적 마이크로RNA 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 이 때 1. 올리고뉴클레오타이드는 표적 마이크로RNA에 상보적이고, 2. 올리고뉴클레오타이드는 표적 마이크로RNA의 첫번째 5'말단 뉴클레오타이드에 해당하는 3'말단 뉴클레오타이드를 함유하지 않는다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88, 및 SEQ ID NO 89로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하는데, 여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100 및 SEQ ID NO 101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하는데, 여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104 및 SEQ ID NO 105로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며, 여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 및 SEQ ID NO 109로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며, 여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68 및 SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 및 SEQ ID NO 46로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 컨쥬게이트를 제공하며, 여기에서, 소문자는 DNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이고, 대문자는 LNA 유닛의 질소 함유 염기를 나타내는 것이며, LNA 시토신은 임의로는 메틸화되는 것이다. 하나의 실시 상태에서, 올리고뉴클레오타이드는 1 내지 17개 뉴클레오염기로 구성된 뉴클레오염기 서열을 가질 수 있는데, 예를 들면, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 뉴클레오염기를 가질 수 있고, 이와 같이 이러한 실시 상태에 있어서의 올리고뉴클레오염기는 본원에 설명된 올리고뉴클레오타이드 범위 내에서 연속적 염기일 수 있다. 본 발명의 발명자들은 특정한 코어 DNA 서열 및 상기 코어 서열 내에 잠금 핵산 (LNA)을 포함하는 특정한 길이의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 우수한 마이크로RNA 억제 특성을 보인다는 것을 의외로 발견하였다.