효소 융합 단백질 및 이의 용도 document_id A220623067137

셀룰로오스는 고등 식물의 주요 구성 성분이고, 코튼 섬유에서만 거의 순수한 형태로 자연적으로 존재한다. 이는 식물 세포에 강한 인장 강도를 부여하여 기계적 스트레스 및 삼투압에 견딜 수 있도록 돕는다. 셀룰로오스는 β-1,4-결합에 의하여 연결된 글루코스 잔기들의 선형 폴리사카라이드이다. 자연에서 셀룰로오스는 대개 리그닌 및 헤미셀룰로오스와 결합되어 있다. 셀룰로오스성 물질은 자연에서 박테리아 및 진균을 비롯한 다수의 다양한 유기체에 의하여 분해된다. 셀룰로오스에서 글루코스로의 생물학적 전환은 일반적으로 3개의 주요 효소군을 필요로 한다: 셀로비오가수분해효소(cellobiohydrolase, CBH), 엔도글루카나제(endoglucanase, EG) 및 베타-글루코시다제(beta-glucosidase, BG). 셀룰라제의 산업적 용도는 광범위하다. 텍스타일 산업에서, 셀룰라제는 데님 피니싱에 사용되어, 바이오스토닝 공정에서 데님 천에 최신 유행의 스톤 워싱된 외관을 창조한다. 또한, 셀룰라제는 예컨대, 보풀을 제거하고 코튼 의류 표면에 필(pill)의 형성을 방지하기 위해 사용된다. 세제 산업에서, 셀룰라제는 색상을 밝게 하고 의류의 그레잉(graying) 및 필링(pilling)을 방지하기 위하여 사용된다. 셀룰라제는 또한 식품 산업 및 동물 사료 제조에도 사용되며, 펄프 및 제지 산업, 예컨대, 섬유 표면으로부터 잉크의 방출을 위한 탈잉크화 및 펄프의 탈수성 향상에서도 지대한 잠재력을 갖고 있다. 산업적으로 사용되는 셀룰라제는 종종 다양한 활성 및 기질 특이성을 갖는 효소들의 혼합물이다. 상업적인 효소 제조품은 종종 3가지 셀룰라제, 즉, CBH, EG 및 BG 활성 모두를 포함한다. 또한, 각 셀룰라제의 독특한 특성으로 인하여 몇몇이 다른 것들보다 특정 목적을 위해 보다 적합하고, 따라서 바람직한 활성만을 갖는 셀룰라제를 수득 및 사용하기 위하여 노력하여 왔다. 가장 널리 사용되는 진균 기원의 셀룰라제는 트리코더마 리제이(Trichoderma reesei)로부터 유도된 것이다. 그러나, 다른 진균 공급원도, 예컨대, 미국 특허 제5,457,046호에서 제안된바 있다. 데님 처리에 적용되는 셀룰라제는 대개 두개의 주요 그룹으로 나뉜다: 산성 및 중성 셀룰라제. 산성 셀룰라제는 일반적으로 pH 4.0 내지 5.5에서 작용하고, 중성 셀룰라제는 pH 6 내지 8에서 작용한다. 산성 및 중성 그룹 모두의 특성을 갖는 셀룰라제를 혼성 셀룰라제라고 칭할 수 있다. 바이오스토닝에 사용되는 산성 셀룰라제는 주로 트리코더마 리제이(생식형 하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina) 기원이고, 중성 셀룰라제는 멜라노카푸스(Melanocarpus), 휴미콜라(Humicola), 마이셀리오프쏘라(Myceliophthora), 퓨사리움(Fusarium), 아크레모니움(Acremonium) 및 크리소스포리움(Chrysosporium)속을 비롯한 다양한 진균으로부터 유래한다(Haakana H, A Miettinen-Oinonen, V Joutsjoki, A Mantyla, P Suominen, 및 J Vehmaanpera. 2004. Cloning of cellulase genes from Melanocarpus albomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enz Microbiol Technol. 34: 159-167). T. 리제이 효소는 예컨대, 글리코실 가수분해효소 패밀리 5(엔도글루카나제 II, EGII), 패밀리 7(셀로비오가수분해효소 I, CBHI) 및 패밀리 12(엔도글루카나제 III, EGIII; Ward M, Shan W, Dauberman J, Weiss G, Larenas E, Bower B, Rey M, Clarkson K 및 Bott R. (1993) Cloning, sequence and preliminary structural analysis of a small, high pI endoglucanase(EGIII) from Trichoderma reesei. Proceedings of the second TRICEL symposium on TRICHODERMA REESEI CELLULASES AND OTHER HYDROLASES, Espoo, Finland, 1993, ed. by P. Suominen and T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8 (1993): 153-158)에 속하는 셀룰라제, 및 가장 빈번하게는 엔도글루카나제인 패밀리 45 및 패밀리 7(Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316; Henrissat B. 및 Bairoch A.(1993) New families in the classification of giycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788; 및 Henrissat B. 및 Bairoch A.(1996) Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695-696)에 속하는 중성 셀룰라제를 포함한다. 미국 특허 제5,874,293호는 증가된 양의 T. 리제이의 EGII 엔도글루카나제를 포함하는, 셀룰로즈 함유 텍스타일의 처리를 위한 개선된 셀룰라제 조성물을 개시한다. 상기 조성물은 색상 특성을 향상시키고, 밝기 및 시각적 외관을 증가시키고 필링 경향을 감소시킨다. 국제특허공개공보 제WO97/14804호는 텍스타일 및 세제 산업에 특히 유용한, 멜라노카푸스속으로부터 유래한 엔도글루카나제 활성을 갖는 하나의 20 kDa 및 하나의 50kDa 셀룰라제를 개시한다. 바람직하게는 트리코더마 리제이 기원인, 셀룰로즈 결합 도메인에 결합된 20K- 및 50K-단백질을 포함하는 융합 단백질이 새로운 효소 특성을 창조하기 위하여 제안된다. 구체적인 예시도 주어지지 않고, 바람직한 특성도 기재된바 없다. 그러나, 직물 처리 및 셀룰라제가 전통적으로 사용되는 다른 분야에서 보다 효율적인 엔도글루카나제를 포함한, 개선된 셀룰라제가 여전히 필요하다. 특히, 공정 경제성을 향상시키기 위한 보다 효율적인 셀룰라제에 대한 계속적인 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키는 것을 목적으로 한다. 텍스타일 산업에서, "스톤-워싱된" 외양 또는 마모된 외양이 최근 데님 제조자들의 관심사였다. 경석(pumice stones)을 이용한 전통적인 스톤-워싱은 직물의 강도를 감소시키고 세탁 장치에 부담을 준다. 효소적 데님 피니싱 공정의 경향이 있고, 셀룰라제는 경석을 대체하여, 또는 경석과 함께 직물에 바람직한 "닳은" 외양을 부여하기 위하여 사용되어 왔다. 조절된 효소 처리는 의복 및 기계에 손상을 덜 주고 스톤의 처리가 불필요해진다. 효소적 스톤-워싱과 관련된 일반적인 문제점은 마모중 또는 마모후 제거된 인디고 염료의 재침착으로 인한 이면오염(backstaining)이다. 인디고 염료의 재침착은 백색 사 및 인디고 염색된 사 간의 바람직한 명암 차이를 감소시키는데, 이는 데님의 배면 및 안쪽 포켓에서 (청색의 증가으로서) 가장 쉽게 주목할 수 있다. 표면에서, 이것은 염색된 구역과 바이오스토닝 동안 염료가 제거된 구역 간의 명암 차 감소로 나타날 수 있다. 이면오염은 처리하는 동안 비이온성 에톡실화 알콜과 같은 이면오염 방지제를 사용하거나, 세정 단계 동안 표백제를 첨가함으로써 감소시킬 수 있다. 효소의 성질이 이면오염에 영향을 준다. 일반적으로 중성 셀룰라제가 산성 셀룰라제보다 이면오염이 적다. 국제특허공개공보 제WO97/09410호에는 마모 활성을 갖는 또 다른 셀룰라제에 특정 유형의 셀룰라제를 첨가하여 이면오염을 감소시킨다고 기재되어 있다. 추가의 셀룰라제는 패밀리 5 또는 7에 속하지만, 그 자체는 유의적인 마모 효과가 없다. 바람직하게는, 상기 추가 셀룰라제는 바실러스(Bacillus) 또는 클로스트리디움(Clostridium)으로부터 기원한다. 미국 특허 제5,916,799호는 제한된 단백질분해를 받아서 효소의 코어와 결합 도메인이 분리된, 셀로비오가수분해효소 및 엔도글루카나제 모두를 포함하는 셀룰라제 조성물을 개시한다. 수득된 효소 조성물은 이면오염을 감소시켰다. 국제특허공개공보 제WO94/07983호는 스톤-워싱 공정 동안 직물 위에 착색제가 재침착하는 것을, 실질적으로 셀로비오가수분해효소 유형의 성분이 없는 진균 셀룰라제 조성물을 이용하여 감소시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 국제특허공개공보 제WO96/23928호에는 말단이 절단된 셀룰라제 효소에 의한 셀룰로즈 함유 직물의 처리가 개시되어 있다. 셀룰로즈 결합 도메인(CBD)이 결여된 말단이 절단된 효소는 염료의 재침착을 감소시키고 마모를 증가시켰다. 앞서 인용된 3개의 문헌으로부터 셀룰로즈 결합 도메인이 이면오염에 부정적 효과를 미친다는 일반적인 결론을 얻을 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 셀룰로즈 결합 도메인이 존재함에도 불구하고 낮은 이면오염 특성을 갖는 셀룰라제 구성을 제공한다. 발명의 요약 본원 발명은 특정 셀룰로즈 결합 도메인을 커플링시킴에 의하여 이면오염 특성을 손상시킴 없이 엔도글루카나제의 효과를 유의성 있게 향상시킬 수 있다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 본 발명의 하나의 목적은 텍스타일 산업, 특히 데님의 스톤-워싱에 사용하기 위한 개선된 가수분해 특성을 갖는 신규한 엔도글루카나제 융합 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 산성 및 중성 pH에서 모두 활성을 갖는 잇점이 있고, 바이오스토닝 용도에서 매우 향상된 성능을 나타낸다. 데님 처리에 사용시, 융합 단백질은 낮은 이면오염 효과를 제공한다. 본 발명의 엔도글루카나제의 개선된 효율성에 의하여, 효소의 사용이 현저하게 절약된다. 보다 적은 양의 효소 제품이 필요하기 때문에, 효소 제품의 물류 및 보관의 측면에서도 추가적인 잇점이 있다. 융합 단백질은 세제 조성물, 및 사료 산업, 식물로부터 오일 추출, 또는 펄프 및 제지 산업과 같은 다른 분야에도 유용하다. 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 엔도글루카나제 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 엔도글루카나제 융합 단백질의 제조에 유용한, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 신규한 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터로 형질 전환된 신규한 숙주를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 신규 엔도글루카나제 융합 단백질을 포함하는 효소 제조품을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 예컨대, 텍스타일, 세제, 동물 사료, 식물로부터 오일 추출, 또는 펄프 및 제지 산업에 사용하기 위한, 특히 텍스타일의 피니싱, 특히 데님의 바이오스토닝 및 바이오피니싱을 위한, 융합 단백질로 셀룰로즈 물질을 처리하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 포함하는 동물 사료 또는 세제 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명은 엔도글루카나제 코어의 제 1 아미노산 서열, 및 서열번호 15와 75% 이상의 상동성을 갖는, 링커 및 셀룰로즈 결합 도메인(CBD)을 포함하는 제 2 아미노산 서열을 포함하는 셀룰라제 융합 단백질, 또는 셀룰로즈 결합 활성을 갖는 이의 변이체 또는 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하기 a) 내지 c)로 구성된 군으로부터 선택되는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다: a) 서열번호 3 또는 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 제 1 항의 셀룰라제 융합 단백질을 암호화하는 서열, b) a)의 상보적 스트랜드, c) a) 또는 b)의 서열중 임의의 것으로의 유전자 코드의 결과로서 축중된(degenerate) 서열. 본 발명은 또한 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터, 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 융합 단백질을 포함하는 효소 제조품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 변환시키는 단계, 및 상기 숙주 세포를 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로 생성된 융합 단백질을 회수 및 정제하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 포함한다. 본 발명은 또한 셀룰로즈 물질을 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 셀룰로즈 물질의 처리 공정을 포함한다. 또한, 본 발명은 셀룰라제 융합 단백질 또는 효소 제조품을 데님 직물 또는 의복과 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오스토닝 공정, 및 셀룰라제 융합 단백질 또는 효소 제조품을 직물 또는 의복 또는 얀(yarn)과 같은 텍스타일 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오피니싱 공정에 관한 것이다. 마지막으로 본 발명은 융합 단백질 및 세제 보조물을 포함하는 세제 조성물, 융합 단백질을 포함하는 동물 사료, 및 등록번호 E. coli DSM 18159를 갖는 Eschrichia coli 균주에 관한 것이다. 본 발명의 구체적인 실시 태양은 종속항들에 제시된다. 본 발명의 다른 목적들, 세부 사항 및 잇점은 하기 도면, 상세한 설명 및 실시예에 의하여 명백해질 것이다.