다능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 분화를 유도하는 방법 document_id A220623067435

(1) 다능성 줄기 세포를 이용한 심근 세포의 제조 일반적으로, 심근 세포는 출생 전에 자율 박동하면서 활발하게 세포 분열하지만, 출생 직후에 그 분열능이 상실되며, 또한 미분화된 줄기 세포나 전구 세포가 극소수로 거의 존재하지 않고 그 증식능 및 분화능도 매우 낮기 때문에, 심근경색이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 심근 세포가 사멸하게 되면, 상실된 심근 세포는 보충되지 않는 것으로 여겨지고 있다. 그 결과, 잔존하는 심근 세포는 대상성 비대(compensatory hypertrophy)를 통해 심장 기능을 유지하고자 하지만, 각종 스트레스가 계속되어 허용 범위를 넘어서게 되면, 추가적인 심근 세포의 피폐, 사멸로 이어져, 심근 기능이 저하(즉, 심부전)되게 된다. 심부전을 비롯한 여러가지 심장병은 일본에서 사망 원인의 두번째를 차지하고 있으며, 그 예후도 매우 나빠 심장 질환자의 5년 생존율은 약 50%에 불과하다. 그러므로, 치료 효과가 높은 심부전 치료법의 개발은 의료 복지의 크나큰 전진과 의료 경제 개선과 직결되는 것으로 생각된다. 심부전 치료제로 종래에는 심근의 수축력을 증가시키는 디기탈리스(digitalis) 제제나 크산틴(xanthine) 제제 등의 강심제가 사용되었지만, 이들 약제의 장기 투여는 심근 에너지의 과잉 소비로 인해 병의 용태를 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 교감 신경계나 레닌-안지오텐신계(renin-angiotensin system)의 항진에 의한 과도한 심장 부하를 경감시키는 β 차단제나 ACE 저해제에 의한 치료가 주를 이루고 있지만, 이는 대증적 치료법에 불과하여, 상해를 입은 심장 조직 자체를 회복시키는 것은 아니다. 이에 반해, 심장 이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 기증자의 부족이나 의료 윤리, 환자의 육체적·경제적 부담의 중압감 등의 문제로 인해 이러한 방법을 일반적인 치료법으로 통용하기는 어렵다. 그 때문에, 쇠약 또는 소실된 심근 세포를 보충적으로 이식하는 방법이 심부전의 치료에 매우 유용할 것으로 생각된다. 실제, 동물 실험에서, 태아로부터 미성숙 심근 세포를 입수하고 이를 성체 심장 조직에 이식하면 이식된 세포가 심근 세포로서 효율적으로 기능한다는 것이 알려져 있다(비특허문헌1 참조). 그러나, 이 방법의 경우 대량의 심근 세포를 입수하기 어렵고, 윤리적 관점에서도 임상 의료에 응용하긴 곤란하다. 그래서, 심근 세포를 미분화한 줄기 세포로부터 분화 유도하고, 이를 이식용 세포로 이용하는 방법이 최근들어 특히 주목을 받고 있다. 현재, 성체 심장 조직에서 심근 세포를 생산할 수 있는 전구 세포 또는 줄기 세포로서 명백하게 동정할 수 있는 세포 집단은 발견되고 있지 않기 때문에, 상기의 방법을 실시하기 위해서는 보다 미분화되고 다양한 분화능을 가지고 있는 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 다능성 줄기 세포(pluripotent stem ceI1s)는 시험관내 배양에 의해 미분화 상태를 유지한 채, 거의 영속적 또는 장기간의 세포 증식이 가능하고, 정상적인 핵형(karyotype)을 나타내며, 적당한 조건 하에서는 모두 3가지 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 계통의 세포로 분화되는 능력을 가지고 있는 세포로 정의된다. 다능성 줄기 세포로는 초기 배아로부터 분리된 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ES 세포), 태아기의 원시 생식 세포로부터 분리된 배아성 생식 세포(embryonic germ cell: EG 세포), 출생 직후의 정소로부터 분리된 생식 세포계열 줄기 세포(germline stem cells : GS 세포) 등이 가장 잘 알려져 있다. 특히, ES 세포는 이전부터 시험관내 배양에 의해 심근 세포로부터 분화 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 초기 연구들은 대부분 마우스 유래의 ES 세포를 이용하여 행해졌다. ES 세포를 단일 세포 상태(효소 처리 등으로 인해 세포끼리 접착되지 않고 각각의 세포가 분산된 상태) 하에서, 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 등의 분화 억제 인자를 존재시키지 않은 상태에서 현탁 배양하였을 때, ES 세포는 서로 접착 및 응집하여 배상체(embryoid body: EB)라고 불리는 초기 배아 유사 구조체를 형성한다. 그 후, EB를 부유 상태 또는 접착 상태로 배양하면, 자율 박동성을 가진 심근 세포가 나타나는 것으로 알려져 있다. 전술한 바와 같이 제조된 ES 세포 유래의 심근 세포는 태아 심장 유래의 미성숙 심근 세포와 매우 유사한 형질을 보인다(비특허문헌 2, 3 참조). 또한, 실제 ES 세포 유래의 심근 세포를 성체 심장 조직에 이식한 동물 실험의 예에서, 태아 심근을 이식한 경우와 마찬가지로, 유효성이 매우 높은 것으로 확인되었다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조). 1995년, 톰슨 등은 최초로 영장류로부터 ES 세포를 수립하였고, 이로써 다능성 줄기 세포에서 유래된 심근 세포를 이용한 심근 재생 치료법의 실용화가 현실성을 띄게 되었다(특허문헌 2, 비특허문헌 5 참조). 계속해서, 이들은 인간 초기 배아로부터 인간 ES 세포주를 분리 및 확립하는 것도 성공하였다(비특허문헌6 참조). 또한, Gearhart 등은 인간 원시 생식 세포로부터 hEG 세포주를 수립하였다(비특허문헌 7, 특허문헌 3 참조). 마우스 ES 세포와 동일하게, 인간 ES 세포를 심근 세포로 분화 유도할 수 있다는 것이, Kehat 등(비특허문헌8 참조) 및 Xu 등(특허문헌4, 비특허문헌9 참조)에 의해 보고되었다. 이들 보고에 의하면, 인간 ES 세포로부터 분화 유도된 심근 세포는 자율 박동능을 가지고 있음은 물론, 미오신 중쇄/경쇄나 α-액티닌, 트로포닌 I 및 심방성 이뇨 펩타이드(atrial natriuretic peptide; ANP) 등의 심근 특이ㅈㄱ 단백질이나, GATA-4이나 Nkx 2.5, MEF-2c 등의 심근 특이적 전사 인자를 발현 및 생산할 뿐만 아니라, 미세해부학적 관찰 및 전기생리학적 분석을 통해 태생기에 미성숙 심근 세포의 형질을 보유하고 있는 것으로 나타나, 재생 의료에서의 이용이 기대되고 있다. 한편, 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포를 세포 이식 치료나 그외 목적으로 사용할 경우의 중요한 문제점은, 종래의 방법에 의해 ES 세포 또는 EG 세포로부터 형성된 EB에서는 심근 세포 외에도 혈구계 세포나, 혈관계 세포, 신경계 세포, 장관계 세포, 뼈·연골 세포 등의 다른 타입의 세포가 혼재하여 발생한다는 것이다. 게다가, 이들이 분화된 세포에서 심근 세포가 차지하는 비율은 그다지 높지 않고, 전체에 약 5 - 20%에 불과하다. 다른 타입의 세포가 혼재하고 있는 가운데 심근 세포만을 선택적으로 선별하는 방법으로는, ES 세포의 유전자에 인위적인 수식을 가하고, 약제 내성 또는 이소성 발현능(ectopic expression)을 부여함으로써, 심근 세포 또는 그의 전구 세포의 형질을 가지고 있는 세포를 회수하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, Field 및 공동 연구자들은, α-미오신 중쇄 프로모터의 제어 하에 네오마이신(G418) 내성 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자 카세트를, 마우스 ES 세포에 도입함으로써, 이들 ES 세포가 심근 세포로 분화되어 α형태의 미오신 중쇄 유전자를 발현할 경우에만, G418이 첨가된 배지에서 생존할 수 있는 시스템을 구축하였다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조). 이러한 방법에 의해 G418 내성 세포로서 선별된 세포는 99% 이상의 확률로 심근 세포인 것으로 확인되었다. 그러나, 이 방법에서는, 심근 세포의 순도는 매우 높아지지만, 최종적으로 얻어지는 심근 세포수가 전체 세포수에 대해 약 몇 퍼센트에 불과하여, 이식 치료에 필요한 심근 세포를 얻는 것은 용이하지 않다. 또, Xu 등은 인간 ES 세포를 5-아자사이티딘으로 처리하면, EB에서 트로포닌 I-양성(심근) 세포가 15%에서 44%로 증가한다는 것을 보고하였다(비특허문헌 9 참조). 그러나, 이러한 방법에서도, 심근 세포가 차지하는 비율은 EB의 50%를 초과하지 않는다. 또한, 탈메틸화제인 5-아자사이티딘은 DNA에 결합된 메틸기를 이탈시킴으로써 유전자의 발현 상태를 변화시키는 약제로서, 약제가 직접 염색체에 작용하기 때문에, 이식용 세포를 제조하는 약제로서는 적당하지 않다. 그외에, ES 세포로부터 심근 세포를 보다 고효율로 발생시키는 방법으로는, 예를 들면, 마우스 ES 세포에서, 레티노익산(비특허문헌 10 참조), 아스코르브산(비특허문헌 11 참조), TGFβ, BMP-2(비특허문헌 12 참조), PDGF(비특허문헌 13 참조), Dynorphin B(비특허문헌 14 참조)의 첨가, 또는 세포내 활성 산소종 (reactive oxygen species ROS)(비특허문헌 15 참조)이나 Ca2+ (비특허문헌 16 참조)을 증가시키는 처리가, 심근 세포의 분화 유도에 촉진적으로 작용한다는 것이 알려져 있지만, 이러한 어떠한 방법으로도 심근 세포 특이적 분화 또는 선택적인 분화 유도는 이루어지지 않았다. 최근, 발명자들을 포함하는 연구 그룹에 의해, ES 세포를 BMP 길항제로 일시적으로 처리하면, 종래 방법에 비해 고효율적이고 선택적으로 심근 세포를 분화 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다(특허문헌 5, 비특허문헌 17). (2) 심근 세포의 분화·발생 과정에 있어서의 Wnt 단백질의 기능적 역할 분비성 단백질인 Wnt 단백질은 척추동물 뿐만 아니라 선충 또는 곤충 등의 무척추동물에서도 널리 그 존재가 인지된 단백질 패밀리 군으로, 이 유전자 패밀리에는 다수의 분자종이 있는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 18, 19). 예를 들면, 인간이나 마우스에서 현재 밝혀져 있는 것은 19 종(Wnt-1, 2, 2b/13, 3, 3a, 4, 5a, 5b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 10b, 11, 16)이다. 이들 Wnt 유전자에 의해 코딩되는 Wnt 단백질 군은 그 조직 특이성 측면에서 각각 다르지만, 구조적으로 서로 유사하다. Wnt 단백질이 리간드로서 세포내 신호 전달 시스템에 기여하는 경우, 이것은 세포막 상에 존재하는 7회 막 관통형의 프리즐드(Frizzled; 이하, Fzd라 함) 패밀리 수용체에 결합한다. Fzd 수용체의 하류에서 작용하는 다수의 경로가 있지만, 가장 주요한 경로로는 글리코겐 합성 효소 키나제(glycogen synthase kinase: GSK)-3β을 통한 β-카테닌의 인산화 억제를 들 수 있다. Wnt 신호가 존재하지 않을 경우, β-카테닌은 APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질 상에서 액신(Axin)에 의해 GSK-3β와 함께 보족(補足)되어, GSK-3β에 의해 신속하게 인산화된다. 인산화된 β-카테닌은 유비퀴틴화되고 프로테아좀에서 분해된다. 한편, Wnt 단백질이 Fzd 수용체에 결합하면, 세포내 인자인 Dishevelled가 활성화되어 GSK-3β이 포획되고, 그로 인해 β-카테닌은 인산화되지 않고 세포질내에서 유리 형태로 잔존하고 동시에 핵내로 이동한다. 핵내로 이동된 β-카테닌은 핵내에 존재하는 림프구 활성화 인자-1/T 세포 인자(lymphoid enhancer factor-1/T cell factor; 이하, LEF-1/TCF)와 결합하여 전사 활성화 복합체를 형성하고, 표적 유전자의 전사를 유도한다. 이러한 β-카테닌의 축적과 핵내 이동을 수반하는 신호 전달 경로를 "고전적" Wnt 경로 또는 카노니칼(canonical) Wnt 신호 경로라고 하며, 해당 경로를 활성화시킬 수 있는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-8a 등의 패밀리 분자 종을 카노니칼 Wnt라 한다. 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화가 각종 GSK-3β 저해제 처리에 의해 유도된다는 것은 공지된 것이다. Wnt 리간드는 Fzd 수용체를 통해서 β-카테닌 경로 이외의 신호 전달 경로도 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, MAP 키나제의 일종인 JNK(Jun N-terminal kinase)를 활성화시키는 평면 세포 극성(Planar cell polarity: PCP) 경로나, 삼량체형 G 단백질의 활성화와 후속적인 포스포리파제(Phospholipase) C의 활성화를 통해서 세포내 Ca2+ 농도를 상승시키고 단백질 키나제 C를 활성화시키는 Ca2+ 경로를 들 수 있다(비특허문헌 19, 20). 이들 경로는 카노니칼 Wnt 신호 경로에 대하여 "비고전적인" Wnt 경로 또는 비-카노니칼(non-canonical) Wnt 신호 경로라고 한다. Wnt-4이나 Wnt-11이 해당 경로를 활성화시킬 수 있는 Wnt 패밀리 분자인 것이 보고되고 있어, 이들 Wnt 리간드는 카노니칼 Wnt 신호 경로에 대해 억제적으로 작용한다. 여전히, Wnt 단백질의 분자 종들 중에는, 작용하는 세포 종이나 그 분화 단계, 해당 세포에서 발현되는 Fzd 수용체의 차이에 따라, 카노니칼 경로 및 비-카노니칼 경로 양자를 활성화시킬 수 있는 것도 있다. 예를 들면, Wnt-5a는 제노푸스 라비스(Xenopus laevis) 배아에서 2차 축 형성이나 유선 상피 세포의 암화 등의 일반적인 검정 시스템에서 비-카노니칼 Wnt로서 작용하는 것으로 알려져 있지만, 한편으로는 ES 세포에 대해서는 β-카테닌의 안정화 및 그것의 전사 활성을 유도하는, 즉 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화시키는 것으로 보고되고 있다(비특허문헌 21). Wnt 단백질은 여러가지 세포·조직이나 암의 발생·증식·분화 과정에 있어서, 각종 다양한 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 심근 세포는 발생 초기 단계에서 측판 중배엽의 일부로부터 발생되며, 그 후, 세포 분열을 반복하면서 증식하여 심장을 형성해간다. 이 과정에서 Wnt 시그널의 유무가 중요한 역할을 담당한다는 것은 몇가지 사례들에서 명확하게 나타났다. 예를 들면, 조류나 제노푸스 라비스의 발생 초기 단계에서, 카노니칼 Wnt 신호 경로를 활성화시키는 Wnt-3a나 Wnt-8a 유전자의 이소적 및/또는 강제적 발현은 심장의 형성을 현저하게 저해하였다(비특허문헌 22, 23). 한편, Wnt-3a나 Wnt-8a와 결합하여 신호 전달을 저해하는 작용을 가진 Frzb 또는 Dkk-1 등의 소위 Wnt 길항제가 심장 형성을 촉진하는 것으로부터, 카노니칼 Wnt 신호가 심근 발생에 대해 저해적으로 작용한다는 것이 시사되었다. 이와는 반대로, 카노니칼 Wnt 신호를 길항하는 비-카노니칼 Wnt 시그널 경로의 활성화는 심근 세포의 발생·분화를 촉진적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. Pandur 등(비특허문헌 24)은, 카노니칼 경로를 활성화시키지 않고 비-카노니칼 경로를 활성화시키는 Wnt-11이 제노푸스 라비스의 심장 발생에 필수적인 인자임을 밝혔다. 그 후, 마우스 ES 세포(비특허문헌 25) 및 인간의 혈관 내피 전구 세포(비특허문헌 26)의 심근 분화 유도 시스템에서도 Wnt-11의 촉진 효과가 동일하게 확인되었다. 또, 비-카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화와 관련하여, 혀 조직으로부터 심근 세포를 분화 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다(특허문헌6). 한편, 상기의 사례와는 달리, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화가 배아성 암종 세포(embryonic carcinoma cell: EC 세포)의 심근 분화를 촉진시킨다는 것이 공지되었다. EC 세포의 일종인 P19 세포의 서브라인인 P19CL6 세포는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO)의 자극 하에서 심근 세포로 분화되는 성질을 가지고 있으며, Wnt-3a나 Wnt-8을 배지에 첨가하면, β-카테닌의 안정화에 따라 심근 세포로의 분화가 촉진되었다(비특허문헌 27). 또, 이 시스템에서, Wnt 단백질을 첨가하는 시기는 분화 유도 직후로부터 4일 동안이 충분한 것으로 확인되었다(비특허문헌 28). P19 세포주는 심근 세포 및 신경 세포로 분화 유도할 수 있다는 점에서 일부 ES 세포와 유사한 형질을 가진다. P19 세포주는 ES 세포와 같은 다양한 분화능이나 키메라형을 형성할 수 있는 능력을 가지고 있지 않으며, 또한, 세포 표면 마커나 발현 유전자 등에 있어 ES 세포와 큰 차이가 있다. 다시 말해, P19 세포주는 어떤 종류의 실험에서는 ES 세포의 모델 시스템으로서 사용될 수도 있지만, 반드시 ES 세포와 동일한 형질을 가진다고하기는 어려우며, 본 실험 시스템에서 확인된 사실을 그대로 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포의 심근 분화 유도 시스템에 직접 외삽(外揷)할 수 있는지는, 과학적 근거를 토대로 예측하기는 어렵다. 최근, 마우스 ES 세포를 이용한 실험 시스템에서, 카노니칼 Wnt인 Wnt-3a 단백질을 분화 유도 시작일 부터 3일간 첨가함으로써, ES 세포의 심근 분화가 촉진된다는 것이 보고되었다(Naito A et al., 28th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 2005.12.7 to 2005.12.10, Hakata, Japan; 비특허문헌 30). 그러나, 본 발명자들이 수행한 유사한 검토에서는, 유의적인 분화 촉진 효과는 인지되지 않았으며(실시예 2), 또한, 다른 연구 그룹에서도 마우스 ES 세포에 Wnt-3a를 처리하더라도 특별히 유의적인 심근 분화 유도 효과가 초래되지 않거나(비특허문헌 25), 저해 효과가 있다(비특허문헌 29)는 보고가 행해지고 있다. 다시 말해, 카노니칼 Wnt 신호 경로의 활성화가 ES 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포의 심근 분화에 미치는 효과는 명확하지 않으며, 심근 분화를 유도하기 위한 최적의 배양 방법이 확립되어 있다고할 수 없는 상황이다. 특허문헌 1: 미국특허 6,015,671 특허문헌 2: 미국특허 5,843,780 특허문헌 3: 미국특허 6,090,622 특허문헌 4: WO03/06950 특허문헌 5: WO2005/033298 특허문헌 6: JP 2005-224155 A 비특허문헌 1: Soonpaa MH et al., Science, 264:98, 1994 비특허문헌 2: Maltsev VA et al., Mechanism of Development, 44:41, 1993 비특허문헌 3: Maltsev VA et al., Circulation Research, 75:233, 1994 비특허문헌 4: Klug MG et al., Journal of Clinical Investigation, 98:216, 1996 비특허문헌 5: Thomson JA et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92:7844, 1995 비특허문헌 6: Thomson JA et al., Science, 282:1145, 1998 비특허문헌 7: Shamblott MJ et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95:13726, 1998 비특허문헌 8: Kehat I et al., Journal of Clinical Investigation, 108:407, 2001 비특허문헌 9: Xu C et al., Circulation Research, 91:501, 2002 비특허문헌 10: Wobus AM et al., Journal of Molecular and cellular Cardiology, 29:1525, 1997 비특허문헌 11: Takahashi T et al., Circulation, 107:1912, 2003 비특허문헌 12: Behfar A et al., FASEB Journal, 16:1558, 2002 비특허문헌 13: Sachinidis et al., Cardiovascular Research, 58:278, 2003 비특허문헌 14: Ventura C et al., Circulation Research, 92:623, 2003 비특허문헌 15: Sauer H et al., FEBS Letters, 476:218, 2000 비특허문헌 16: Li J et al., Journal of Cell Biology, 158:103, 2002 비특허문헌 17: Yuasa S et al., Nature Biotechnology, 23:607, 2005 비특허문헌 18: Nusse R, Cell Research, 15:28, 2005 비특허문헌 19: Widelitz R, Growth Factors, 23:111, 2005 비특허문헌 20: Luhl M et al., Trends in Genetics, 16:279, 2000 비특허문헌 21: Hao J et al., Developmental Biology, 290:81, 2006 비특허문헌 22: Schneider VA 0026# Mercola M, Genes and development, 15:304, 2001 비특허문헌 23: Marvin MJ et al., Genes and Development, 15:316, 2001 비특허문헌 24: Pandur P et al., Nature, 418:636, 2002 비특허문헌 25: Terami H et al., Biochemical and Biophysical Research Communication, 325:968, 2004 비특허문헌 26: Koyanagi M et al., Journal of Biological Chemistry, 280:16838, 2005 비특허문헌 27: Nakamura T et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100:5834, 2003 비특허문헌 28: Naito AT et al., Circulation Research, 97:144, 2005 비특허문헌 29: Yamashita JK et al., FASEB Journal, 19:1534, 2002 비특허문헌 30: Naito AT et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103:19812, 2006