ＤＮＡ 단편화 시험방법 document_id A220623073054

정상적으로 기능하는 생물학적 시스템에서, 세포 수는 세포 증식과 아폽토시스(apoptosis) 사이의 균형에 의해서 조절된다. 세포 증식과 아폽토시스 사이의 부적절한 균형은 다수의 질환의 병인과 관련되고 있다. 예를 들어, 아폽토시스 기전의 악화는 알츠하이머병과 같은 신경변성 질환, 다발성 경화증으로 예시되는 자가면역 질환 및 졸중과 같은 허혈-연관된 손상의 원인인 것으로 생각된다. 반대로, 적절한 아폽토시스 경로의 완화는 암과 같은 질환의 근본적 기전인 것으로 생각된다. 아폽토시스는 세포 수축 및 세포막 소포형성, 염색질 응축, 핵 DNA 단편화(fragmentation) 및 단백질 분해를 포함하는 몇 가지의 특질을 특징으로 한다. 여기에는 적어도 두 가지의 구별가능한 아폽토시스 경로가 있는데, 즉 외인성 및 내인성 경로이다 (예를 들어, 문헌[Oncogene 23:2861-2874, 2004; Photochem. Photobiol.Sci. 3:721-729, 2004]을 참조). 외인성 또는 수용체-매개된 경로는 종양 괴사 인자와 같은 사멸 수용체 리간드(death receptor ligand)에 의해서 유도된다. 사멸 수용체 리간드는 카스파제 캐스케이드(caspase cascade)를 통해서 신호를 보내며, 궁극적으로는 카스파제 활성화된 뉴클레아제에 의한 핵 DNA 절단을 야기한다. 미토콘드리아 기전을 통해서 신호를 보내는 내인성 경로는 자외선 또는 약물과 같은 환경적 스트레스 요인에 대해서 민감하다. 이들 스트레스는 미토콘드리아 막의 투과화를 야기하여 사이토크롬 c, 엔도뉴클레아제 G, 아폽토시스 유도인자 (AIF) 뿐만 아니라 다수의 다른 미확인 분자들의 방출을 유도한다. 아폽토시스에 대한 외인성 또는 내인성 경로의 상대적 기여도는 아폽토시스유도성(proapoptotic) 인자와 세포 생존 인자 사이의 균형에 의해서 결정된다 (검토를 위해서는 문헌[J. Intern. Med. 258:479-517, 2005]을 참조). 아폽토시스는 사멸 수용체 리간드 결합, 아폽토시스 유도인자의 활성화, 카스파제의 활성화, 세포생존 분자의 하향 조절을 통해서, 또는 그 밖의 다른 공지 및 미지의 신규 기전을 통해서 유도될 수 있다. 이들 모두는 DNA 단편화를 유도하며, 따라서 표현형적 DNA 단편화 시험방법은 작용 방식과는 무관하게 모든 아폽토시스-유도 화합물을 확인하고, 잠재적으로 신규의 기전을 갖는 화합물을 확인할 수 있을 것이다. 겔-기본 DNA 래더(ladder) 시험방법은 가장 표준적인 DNA 단편화 시험방법이다. 그러나, 겔-기본 DNA 래더 시험방법의 노동-집약적인 다단계 성질은 고효율 스크리닝 노력에는 적합하지 않다. 따라서, 고전적인 아폽토시스 경로 및 새로운 기전을 통해서도 작용하는 약제를 확인할 수 있는 스크리닝 시험방법이 필요하다. 세포독성 시험방법이 잠재적으로 사용될 수 있었지만, 이들 시험방법은 이들이 아폽토시스- 및 비아폽토시스-매개된 세포사멸 둘 다와 관련된 화합물을 확인하는데 있어서 비-선택적이며, 상당한 허위 양성을 유도할 수 있다. 고효율 스크리닝에 적합한 비-방사성 및 로버스트(robust) 시험방법이 바람직할 것이다. 현재는, 3 가지 상이한 포맷(format)이 아폽토시스와 관련된 화합물을 스크리닝하는데 이용된다. 첫 번째는 방사선분석 여과방법(radiometric filtration method)을 기본으로 하며, 여기에서는 세포를 3H-티미딘 중에서 성장시킨 다음에 단편화된 DNA로부터 유리-섬유 여과 플레이트를 사용하여 온전한 DNA를 분리시킨다[참조: Anal. Biochem. 242:187-196, 1996]. 방사선분석 시험방법의 처리량은 대량의 방사선과 연관된 위험성 및 시험방법의 힘이 드는 성질로 인하여 제한된다. 두 번째 시험방법 포맷은 트랜스퍼라제 효소에 의해 형광성-dUTP로 3'' 이본쇄 DNA (dsDNA)를 표지한 다음에, 유동 세포 측정법 또는 영상화 방법에 의한 검출을 기본으로 하는 TUNEL 시험방법이다. 이용할 수 있는 다수의 TUNEL 시험용 키트가 있지만, 이들은 모두 노동집약적이고, 시험방법 당 단지 소수의 샘플만을 시험할 수 있다. 세 번째 시험방법 포맷은 항-DNA 및 항-히스톤 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 시험방법이다. 이 시험방법도 또한 노동집약적이며, 두 가지 항체의 필요성으로 인하여 고효율 화합물 스크리닝에 비교적 비용이 많이 든다. 효율적이며 비방사성인 시험방법 포맷은 피코그린(PicoGreen) 또는 프로피듐 요오다이드와 같은 DNA 삽입체(intercalator)를 사용하여 단편화된 DNA를 검출하는 것이다. 예를 들어, 피코그린은 dsDNA의 주된 홈(groove)에 삽입(intercalation)되는 작은 유기분자이다. 피코그린은 혈액 샘플 내의 DNA 레벨을 조사하는 유용한 도구가 되고 있다[참조: Scan. J. Immunol. 57:525-533, 2003; Clin. Immunol. 106:139-147, 2003; Blood 102(6):2243 - 2250, 2003]. DNA 삽입체를 사용하여, 본 발명은 세포 내에서 DNA 단편의 형성을 변형시키는 약제를 검출하는 방법을 제공하며, 이는 고효율 스크리닝 적용을 위해서 개량할 수 있다.