제대혈(臍帶血) 줄기 세포 수집 및 그 사용 방법 document_id A220623073061

성체 대혈 수집 방법과 대혈 이식법 제대혈 세포(Umbilical CB cells)는 조혈 악성 종양 그리고 골수 부전 증후군을 위한 유전적으로 다른 동종의 조혈모세포 이식을 수행하기 위한 조혈모세포(Hematopoietic stem cell)의 유용한 공급원이다. (Kurtzberget al., 1996; Wagner et al., 1996; Gluckman et al., 1997; Rubinstein et al., 1998) 유의할 만한 잇점은 전국적인 CB 은행에 저장된 CB 세포에 신속한 접근과 희귀한 중증 대숙주성 이식편병(對宿主性移植片病)(GVHD)에 기인한 1-2 인 백혈구 항원 불일치이식의 허용은 정합되는 비혈연의 공여자 이식에 비유된다.(Barker et al., 2002) 특히 소수 그룹의 환자들 사이에, CB세포는 환자가 조혈 악성 종양(hematological malignancie)을 위한 치료옵션으로 유전적으로 다른 동종간의 이식을 선택하는 것이 가능하게 한다. 상기 잇점에도 불구하고, CD34+ 세포와 전구 세포(progenitors)를 포함하여 CB의 사용은 불충분한 세포수로 인하여 성채에 있어서 제한되어 진다. 전체 무핵 세포 계수의 낮은 단계들을 사용한 CB 이식은 호중구(neutrophil)의 후-이식 접붙임에서 유의할 만한 지연과 혈소판 또는 이식 부전을 초래한다. (Wagner et al., 2002; Laughlin et al., 2004) 도달된 태반으로부터 중력에 의하여 낙하하는 혈액 그리고 수집 백(bag)이나 주사기안으로 정맥천자(venipuncture)에 의한 혈액 낙하를 포함하여 CB수확 방법이 알려져 있다. CB공급이 단 일회 사용하기에 겨우 맞을 정도 또는 최근에는 2 비동일 공여자로부터 2개 CB 제공을 사용하여 그 이상 겨우 맞을 정도이어서, 성체 CB 이식은 임상 결과에 기초하여 비혈연의 잘 맞는 공여자가 없을 경우에 한하여 일반적으로 실행된다. 실제로, 단지 20~ 40㎖의 복구는 흔치않으며, 이들 CB세포들은 사용되거나 저장되지도 않는다. (Lasky et al., 2002; George et al., 2006) 그러한 경우로, 수집되지 않은 CB세포의 의미있는 양은 여전히 태반에 남아 있으며 이를 보충하기 위한 초기 수확 후에 수집할 수 있는 표준화된 보충 방법이 없기 때문에 버려진다. 미래에 CB은행 공여자 풀을 확장시키기 위하여, 전통적인 CB 수확 후 남겨진 잔여 CB 세포들을 수집하는 방법을 포함한 개선된 방법의 연구가 중요하다. (Harris et al., 1994) 더욱 중요하게, 같은 태반으로부터 CB 세포의 증가된 양의 유용성은 세포유전자치료제 확장과 입양 면역요법과 같은 백업 또는 이식 기술을 포함하여 다양한 사용을 위하여 CB 세포들의 양을 충분하게 저장할 수 있다. HSC에 있어서 재현과 조직 재생 현대 지식 지난 10년 이상, 복사, 자체-재생, 분화하는 줄기 세포의 많은 형태는 사람에게 동속(同屬)으로 인정되었다. 전분화능 줄기 세포는 신체 세포의 모든 형태로 형성될 수 있는 능력이 있으며, 이러한 세포는 사람 ES 세포(배성간세포, 만능세포)로 불리는 초기 배아줄기 세포 범위에 있는 것이다. 태생기전능줄기 세포(Pluripotent stem cells)는 내배엽, 중배엽, 외배엽으로 발달할 수 있는 능력이 있다. 조직특이 줄기 세포(Tissue specific stem cell)는 단지 어떤 조직을 만드는 데에만 전념한다. 예를 들면 조혈모세포(HSC)는 다른 조직 형태가 아닌 혈액의 모든 형태를 담당하고, 치료 능력을 위하여 성체안에서 계속 존재하게 된다. 그러나, 연구자들은 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cells)의 다른 형태의 생산을 담당하는 것으로 간주되는 성체 HSC는 신경 세포 또는 근육 세포등과 같은 다른 조직, 기관의 세포 조차도 증가시킨다는 것도 발견하였다. 성체 HSC의 전이분화(transdifferentiation)에 대한 연구 결과는 능동적인 연구자들에 의하여 논쟁이 계속될 여지가 있다. 대조적으로, 많은 수의 임상에서는 BM 이식 또는 심장 이식 후에 비조혈세포 생성의 증거가 보고되었다. BM 이식후에 두뇌로의 BM 이식을 돌이켜 검토하여 보면 세포 융합없이 장기간 설정하에 신경생성(Neuropoiesis)의 증거와 그리고 성상세포(astrocytes)와 미세신경(microglia)의 검출 증거를 보여주고 있다. (Cogle et al., 2004) 다른 보고들은 골아세포, 간세포, 위-장(GI) 관 상피(tract epithelia), BM 이식후의 기질, 각막세포, 조혈세포,GI 관/주변 혈액 줄기 세포 이식 후 피부 상피에서 공여자 세포의 검출에 주목하였으며; 그리고 심장 이식후에 내피세포층이 있거나 없는 심장근육세포가 넓은 범위에 걸친 백분율 합계로 발견되었다.(Hruban et al., 1993; Theise et al., 2000; Korbling et al., 2002; Muller et al., 2002; Okamoto et al., 2002; Quaini et al., 2002). 성체 줄기 세포의 공급원으로서의 제대혈세포 인간 ES 세포는 분화될 수 있고, 시험관내에서 전구 세포의 다른 형태를 생산하기 위하여 성장할 수 있으며, 환자에 대하여 그 응용은 현재 여러 가지 도덕적 논쟁에 의하여 방해받고 있다. 추가로, 배아줄기 세포-추출된 전구 세포의 순수한 논쟁은 해결되어야 한다. 대조적으로, 조혈 조직으로부터 추출되는 골수 그리고 태반 제대혈 세포를 포함한 성체 줄기 세포 개체군은 적당한 자극에 대하여 노출되는 외배엽과 내배엽으로 분화될 능력이 있음이 발견되었다. (Eglitis and Mezey, 1997; Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000; Sanchez-Ramoset al., 2001; Chen et al., 2005) 특히, 줄기 세포를 추출하는 CB는 일반적으로 폐기되던 태반으로부터 수집되기 때문에 다른 공급원에 비하여 더욱 잇점이 있는 것이고, 이와 같이 세포를 수확하기 위하여 숙주(host)에 대하여 조직 손상이 없게 된다. BM 세포에 대하여 비교하면, CB는 순수 면역상태와 말단립(Telomere) 길이가 상대적으로 단축되지 않는 원시적 개체발생력을 가지고 있다. 태생기전능(pulripotent) 체강(somatic) 줄기 세포가 존재하든지 여부에 관련한 논쟁가운데, CB 그리고 태반으로부터 추출한 세포는 임상적 개발 가능성에 대하여 흥미있는 유의점을 가지고 있는 것으로 인하여 주목받고 있다. 최근에는, CB는 조혈 세포 개체 증가를 포함하는 것으로 보여지며, 태생기전능세포의 공급원으로 인정되고 있다. (Goodwin et al., 2001; Sanchez-Ramos et al., 2001; Bicknese et al., 2002; Sanchez-Ramos, 2002; Zigova et al., 2002) 다른 연구에 의하면 계보 양성 세포 소모(depletion) 후 CB 세포의 일주일간 배양으로부터 분리되어진 착생 세포 개체군은 외배엽과 내배엽 특징의 면역조직화학(immunohistochemical) 증거를 나타내기 위하여 보여진다. (McGuckin et al., 2004) 신경 퇴화 질병 크라베 백혈구 발육 이상증(Krabbe leukodystrophy)으로부터 고통받은 어린이에 대하여 일련의 성공적인 CB 이식이 보고되었다. (Escolar et al., 2005) 본 발명자는 CB 줄기 세포에서 발견된 이들 고유의 특성은 재 태반은 배아 발육 동안 조혈 영역이 될 것이라는 근래에 발간된 새로운 개념으로부터 비롯된다는 가설을 세웠다. (Gekas et al., 2005; Ottersbach and Dzierzak, 2005) 만기(full-term) 태반은 혈관 오목(niche)에 유착하는 잔여 원시 줄기 세포를 포함함은 물론이고, 혹은 탄생에 연관된 스트레스에 기인할 가능성은 태반 오목부로 이동 완료된 태아 BM 또는 간으로부터 방출되는 혈중 줄기 세포의 수가 증가될 것이라고 쉽게 가정할 수 있다. 이와 같이, 본 발명자는 이 혁신에 의하여 얻어 지는 CB 세포를 추출한 태반은 배아기 이후에 태반 혈관계 오목위치에서 침착된 잔여 줄기 세포와 같이 남겨진 좀더 많은 원시적인 줄기 세포(ES 세포-유사 세포)를 포함하게 될 것이라는 가설을 세웠다. ES cell-like cells 와 원시 HSC를 포함하는 원시 CB 세포 분리와 선택 일반 줄기 세포 표지를 규정하기 위하여 배아, 그리고 신경 세포, 단지 하나의 유전자로 부터 유전 표현 형태의 비교 해석을 사용하여 규정된다. (아마도 기술적 어려움에 기인한 듯함)(Fortunel et al., 2003) 이와 같이, 규정하고 줄기 세포를 선택하는 것은 이들 세포를 분리하기 위한 몇가지 표지가 여전히 요구된다. 줄기 세포 구분을 위하여 사용될 수 있는 하나의 특성은 분화의 지표의 결여이다. 이러한 접근은 치료를 위하여 채용되어야 하는 줄기 세포의 농축을 수행하여야 하는 HSC 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다. 이러한 "음성계(Lineage negative (Lin-)" 특징은 많은 줄기 세포 개체군의 특성이다. (Cai et al., 2004b) Lin- CB 세포로부터 줄기 세포 개체군을 더욱 농축시키기 위하여, CD133+ 표지가 성장 인자 자극에서 높은 증식 가능성을 보여주고 있다고 보고되었다. CD133+/CD34- 부분집합은 메틸셀룰로오스(methylcellulose)에서 집락 형성 세포(CFC)를 생산하지 않는 것과 같은 더욱 원시적인 줄기 세포가 재현될 것이라는 다른 보고서가 있으며, 그러나 가장높은 SCID(severe combined immunodeficiency(중도(重度) 복합 면역 부전증)) 재증식 세포 빈도를 보였다. (Kuci et al., 2003) 배아 항원 (SSEA)-3, SSEA-4, TRA-1-60, and TRA-1-81 특이 기(期)와 같은 배아 줄기 세포 표지는 오로지 FACS 분석(상용으로 이용가능한 것)과 호환가능한 태생기전능세포와 항체들의 특성화에 광범위하게 사용되어 온 ES 세포로 표현되었다. 최근에는 Kucia et al.(기타 복수인)은 저술에서 원시 줄기 세포 개체군은 Lin-/CD45-/CXCR4+/CD133+/CD34+ 표현형(Kucia et al., 2006)을 수반하는 "매우 작은 배아-유사(VSEL) 줄기 세포"로 칭하였다. 이러한 세포들은 배아 이식 인자 Oct-4와 Nanog에 대하여 양성이 된다. 또는, 일반 대사 표지들의 존재를 사용하는 방법은 줄기 세포를 규명하고 분리하는 용도로도 사용된다. 전술한 대사 표지의 하나는 알데히드 탈수소효소이다. (ALDH) (Takebe et al., 2001) ALDH의 형광 기질,복사(줄기 세포)는 신경 줄기 세포(Cai et al., 2004b; Corti et al., 2006)와 HSC(Storms et al., 1999)에서 ALDH 활성을 증가시킨다고 증명되었다. 이러한 비중독, 생 표지법은 다른 줄기 세포 개체군에 대하여도 규명하기 위하여 사용될 수 있다. (Cai et al., 2004a) 더 나아가, 로다민 흡수 그리고 Hoechst 염색 표지는 BM, CM, 중간엽, 근육, 그리고 성체 뇌로부터 줄기 세포 개체군을 선택하기 위하여 사용된다. (Kim et al., 2002; Bhattacharya et al., 2003; Migishima et al., 2003; Parmar et al., 2003). Hoechst 염색 33342의 lowuptake에 의하여 설명된 종속 개체군 (side population (SP))은 자가- 재생 그리고 태생기전능의 가장 높은 능력을 기술한다. Hoechst 염색 흡수는 ABCG2 전달체 멤브레인에 의하여 규제되며 그리고 SP 개체군은 ABCG2 단백질의 발현과 같이 정의된다. (Zhou et al., 2001; Scharenberg et al., 2002) ABCG2단백질은 특이하게 신경 줄기 세포에 있어서 유전자를 발현시킴과 아울러, 선구 세포의 분화시에 유전자 발현을 감소시킨다. (Cai et al., 2002) 인간 조혈 세포 계로부터 외배엽세포 이식분화(transdifferentiation)의 증거 이들 세포가 쥐에 있어서 근육, 아교 세포, 그리고 간세포로 분화되었다는 첫 번째 보고가 있은 후에 신경 세포로 원종 분화 유도된 BM 기질의 보고가 증가하고 있다. (Azizi et al., 1998; Ferrari et al., 1998; Petersen et al., 1999) 네스틴(Nestin)과 같은 신경 특이 단백질 유도, 신경-특이 핵산 단백질(NeuN) 그리고 사람으로부터 추출된 세포에서 아교 산염 섬유 단백질(GFAP) 그리고 설치류 BM 기질 세포의 시험관 증거는 레티노산, 표피조직 성장 인자(EGF), 또는 향신경인자(BDNF)로 자극 후 보고되었다. (Sanchez-Ramos et al., 2000) 비-중간엽 조혈 전구 세포중에는, 몇가지 보고서에서 분리된 CD133+세포를 포함하는 인간 CB 단핵세포는 시험관에서 베타-튜브린(tublin) III, 기본적인 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)와 hEGF에 대한 노출 후 GFAP, 또한 레티누산 그리고 신경 성장 인자(NGF) 노출 후의 Musashi-1에서와 같이 신경 그리고 아교 표지의 발현을 유도하는 것이 발표되고 있다. (Sanchez-Ramos et al., 2001; Bicknese et al., 2002) 조혈 세포 계로부터 내배엽 세포 전이분화의 증거 전술한 바와 같이, 간세포는 쥐모델에서 BM세포로부터 추출하여 변형되어 지는 것으로 알려져 있으나 (Lagasse et al., 2000), 특별한 간 재생 모델에서 세포 융합에 의한 것으로 원인이 밝혀 졌다(Wang et al., 2003b). 다른 연구자들도 BM HSC 공급원으로부터DML 골수단핵구백혈병(myelomonocytic)세포는 간세포 상대의 주요한 공급원이 된다는 것을 발견하였다. (Camargo et al., 2004) 일주일간의 성형된 착생 세포 경작에 의하여 수행되는 계 양성 세포 고갈 과정으로부터 분리된 CB 세포는 간세포 성장 중간에서 좀더 양육된 후 간 세포에 대한 표지가 발현된다는 것을 발견하였다. (McGuckin et al., 2005) CB CD34+.CD38-CD7- 이식 후 면역이 불충분한 쥐들을 대상으로 CCl4로 처치한 간에서 유사 간세포 발달의 생체내 증거가 보고되었고(Wang et al., 2003a), 더욱 최근에는 태아 양을 사용한 비-손상 모델, 사람 간세포가 인간 HSC, CD34+/Lin-, CD34-/Lin- , CD34+/Lin-/CD38-, CD34-/Lin-/CD38-, CD34+/Lin-/CD133+, BM, 주변 혈액, 또는 CB로부터 유도된 CD34+/Lin-/CD133-을 포함하는 태아 양의 BM 구성을 통하여 생성된다. (Almeida-Porada et al., 2004)