미세유체화된 수중유 유화액 및 백신 조성물 document_id A220623073107

박테리아, 바이러스, 기생충 및 마이코플라즈마 감염은 소, 돼지 및 애완 동물과 같은 가축에 널러 퍼져있다. 이런 감염원으로 인한 질병은 종종 항생제 치료에 저항하여, 효과적인 치료 수단이 없을 수 있다. 결과적으로, 가축의 감염성 질병을 구제하기 위해 백신적 접근법이 점점 더 많이 사용되고 있다. 전체 감염성 병원균이, 화학적 불활성화나 적절한 유전자 조작 후에, 백신 제제에 사용하기에 적합하게 제조될 수 있다. 다르게는, 백신 제제에서 사용하기 위해 병원균의 단백질 서브유닛을 재조합 발현 시스템에서 발현시켜 정제할 수 있다. 보조약은 일반적으로 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 전형적인 백신은 죽은 병원성 미생물의 조질 제제로 구성되어 있고, 병원성 미생물의 배양물과 관련된 불순물이 면역 반응을 개선시키기 위한 보조약으로서 작용할 수 있다. 그러나, 병원성 미생물 또는 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제가 백신 접종용 항원으로서 사용되는 경우, 이런 항원에 의해 유발된 면역성이 열악하고, 따라서, 보조약으로서 일부 외래 물질을 첨가해야만 한다. 또한, 합성 및 서브유닛 백신은 제조비가 비싸다. 따라서, 보조약의 도움을 받아, 면역 반응을 자극하는데 더 작은 투여량의 항원이 요구되어, 백신 제조 비를 절감할 수 있다. 보조약은 다수의 서로 다른 방식으로 작용하여 면역 반응을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 많은 보조약은 면역 반응과 관련된 사이토카인 네트워크를 변형시킨다. 이들 면역조절성 보조약은 이들이 항원과 함께하지 않을 때조차 이들의 효과를 발휘할 수 있다. 일반적으로, 면역조절성 보조약은 일부 사이토카인을 전반적으로 상승-조절시키고, 동시에 다른 것들을 하향-조절하여 세포 Th1 및/또는 체액 Th2 반응을 이끌어낸다. 일부 보조약은 항원의 형태 일체형을 유지시켜 항원이 적절한 면역 작동체 세포에 효과적으로 제시될 수 있게 한다. 보조약 제제에 의해 항원의 형태가 유지된 결과, 백신은 면역 자극 복합체(ISCOM)에서 볼 수 있는 것과 같이 증가된 저장성을 가질 것이다. 오젤(Ozel M.) 등의 문헌[Quarternary Structure of the Immunestimmulating Complex(Iscom), J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989)]을 참조할 수 있다. 일부 보조약은 주사 부위에서 저장소로서 항원을 보유하는 능력을 갖고 있다. 이 저장 효과의 결과로 항원은 간 청정에 의해 신속하게 손실되지 않는다. 알루미늄 염 및 유중수 유화액은 더 짧은 기간동안 이 저장 효과를 통해 작용한다. 예를 들면, 유중수 유화액인 프롱드 완전 보조약(FCA)을 이용함으로써 장기간 저장소를 수득할 수 있다. FCA는 전형적으로 생물학적 분해가 항원-제시 세포에 의한 항원 제거를 허용할 때까지 주사 부위에 남아 있는다. 이들의 물리적 성질에 근거하여, 보조약은 입자성 보조약과 비-입자성 보조약이라는 2개의 매우 넓은 카테고리로 분류될 수 있다. 입자성 보조약은 마이크로입자로서 존재한다. 면역원은 마이크로입자에 혼입되거나 이와 결합할 수 있다. 알루미늄 염, 유중수 유화액, 수중유 유화액, 면역 자극 복합체, 리포좀 및 나노- 및 마이크로입자가 입자성 보조약의 예이다. 비-입자성 보조약은 일반적으로 면역조절자이고, 이들은 일반적으로 입자성 보조약과 함께 사용된다. 뮤라밀 다이펩타이드(마이코박테리아에서 추출된 펩티도글리칸의 보조약-활성 성분), 비-이온성 블록 공중합체, 사포닌(퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 나무의 껍질에서 추출된 트라이터페노이드의 복합 혼합물), 리피드 A(2개의 포스페이트 기와 일반적으로 길이가 C12 내지 C16인 5 또는 6개의 지방산 쇄를 갖는 글루코사민의 다이사카라이드), 사이토카인, 탄수화물 중합체, 유도된 폴리사카라이드 및 박테리아 독소, 예를 들면 콜레라 독소 및 이. 콜라이(E.Coli) 불안정 독소(LT)가 비-입자성 보조약의 예이다. 가장 잘 알려진 보조약의 일부는 보조약 제제에 저장 효과를 부여할 수 있는 입자성 물질과 비-입자성 면역조절자의 조합이다. 예를 들면 FAC는 오일 유화액의 단기간 저장 효과와 함께 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 면역조절 성질 성분을 조합한다. 오일 유화액은 장기간용 백신 보조약으로 사용되어 왔다. 르 모이그닉(Le Moignic)과 피오니(Piony)는 1916년에 광유중의 죽은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 현탁액이 면역 반응을 증가시킴을 발견하였다. 이어서, 1925년에 라몬(Ramon)은 디프테리아 독소에 대한 항독소 반응을 증대시키는 물질중 하나로 전분 오일을 개시하였다. 그러나, 오일 유화액은 프롱드가 현재 프롱드의 완전 보조약(FCA)으로 알려진 그의 보조약 제제를 들고 나왔을 때인 1937년까지는 대중화되지 않았다. FCA는 죽은 마이코박테리아와 아라셀(Arlacel) A와 혼합된 광유(파라핀 오일)로 구성된 유중수 유화액이다. 아라셀 A는 주로 만나이드 모노올리에이트이고, 유화제로서 사용된다. FCA가 항체 반응을 유도하는데 뛰어나긴 하지만, 이는 심한 통증, 종기 형성, 발열 및 육아종 염증을 야기한다. 이런 바람직하지 못한 부작용을 피하기 위해, 불완전 프롱드 보조약(IFA)이 개발되었다. IFA는 마이크로박테리아 성분이 없는 점을 제외하고는 조성이 FCA와 유사하다. IFA는 주사 부위에서 저장 제제를 통해 작용하고 항체-생성 세포를 활성화시키면서 항원을 서서히 분비시킨다. FCA를 개선시키고자 하는 다른 접근법은 광유를 생물학적 상용성 오일로 대체하면 주사 부위에서 FCA와 연관된 반응이 없어지는 것을 도울 수 있다는 견해에 근거하였다. 또한 유화액은 주사 부위에서 장기간 지속되는 저장소를 생성하는 유중수가 아니라 수중유이어야 하는 것으로 생각되었다. 힐만(Hilleman) 등은 86% 호마유, 유화제로서 10% 아라셀 A 및 안정화제로서 4% 알루미늄 모노스테아레이트로 구성된 오일-계 보조약인 "보조약(Adjuvant) 65"를 개시하였다. 힐만(Hilleman) 등의 문헌[1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182]; 힐만 및 비알레(Beale)의 문헌[1983, in New Approaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. and Torrigiani, G. ), Schwabe, Basel]을 참조할 수 있다. 인간에서, 보조약 65는 안전하고 효능이 있지만, IFA에 비해 더 적은 보조약성을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 보조약 65의 경우 일부 로트의 백신을 맞은 사람들의 경우에 반응원성(reactogenicity)이 나타나고, 아라셀 A 대신 정제되거나 합성된 유화제를 사용할 경우 보조약성이 감소되어서 이의 사용이 중단되었다. 미국 특허 제5,718,904호 및 제5,690,942호는 수중유 유화액중의 광유가 안전성 프로파일을 개선시키기 위한 목적으로 물질대사될 수 있는 오일로 대체될 수 있음을 개시하고 있다. 보조약성과 안전성 이외에도, 유화액의 물리적 외형 또한 중요한 상업적 고려점이다. 물리적 외형은 유화액의 안정성에 의존한다. 크림을 형성하거나, 침강되고 응집되는 것은 유화액이 불안정하다는 지표이다. 크림을 형성하는 것은 유화액의 유상과 수상이 서로 다른 비중을 갖고 있을 때 발생한다. 크림형성은 또한 유화액의 초기 소적 크기가 크고, 유화액 소적이 임의의 브라운 운동을 하지 않을 때 일어난다. 소적 크기가 큰 경우, 계면이 파괴되고 소적이 응집하여 큰 입자를 형성하는 경향이 있다. 유화액의 안정성은 사용되는 유화제의 특성 및 양, 유화액중의 소적의 크기 및 유상과 수상 사이의 밀도의 차이와 같은 다수의 인자에 의해 결정된다. 유화제는 계면 유리 에너지를 감소시키고, 소적 응집에 대한 물리적 또는 정전기 차단벽을 형성시킴으로써 분산된 소적의 안정화를 촉진시킨다. 이온성 세제뿐 아니라 비이온성 세제를 유화제로 사용하여 왔다. 비이온성 유화제는 계면을 향하고, 비교적 체적이 큰 구조를 생성하고, 이로 인해 분산된 소적의 입체 회피가 야기된다. 음이온성 또는 양이온성 유화제가 짝이온을 잡아당김으로써 전기적 이중 벽의 형성을 유도하고; 이중 층 반발력으로 인해, 소적들이 접근할 때 서로 밀어내게 된다. 유화제를 이용하는 것에 추가하여, 유화액의 안정성은 또한 기계적 수단에 의해 유화액의 소적 크기를 감소시킴으로써 수득될 수 있다. 전형적인 프로펠러 믹서, 터빈 로터, 콜로이드 밀, 균질화기 및 소니케이터를 이용하여 유화액을 제조하여왔다. 미세유체화는 유화액중의 소적의 크기의 균질성을 증가시키는 다른 방법이다. 미세유체화는 마이크론 미만의 범위인 일정한 입자 크기를 갖는 물리적으로 안정된 훌륭한 유화액을 만들 수 있다. 유화액의 안정성을 증가시키는 것 이외에도, 미세유체화 공정은 최종 생성물의 멸균성을 보증하는 바람직한 방법인 말단 여과를 가능하게 한다. 더욱이, 마이크론미만의 오일 입자는 주사 부위를 통과하여 임파선으로 들어간 후, 배액 체인의 림프절, 혈액 및 비장으로 갈 수 있다. 이는 국소 염증과 유의한 주사 부위 반응을 일으킬 수 있는 오일 저장소가 주사 부위에서 확립되는 경향을 감소시킨다. 미세유체화기는 이제 상업적으로 이용가능하다. 2개의 유체화된 스트림이 상호작용 챔버 내에서 높은 속도로 상호작용하는 동안 미세유체화기에서 유화액이 형성된다. 미세유체화기는 공기 또는 질소 구동되고, 20,000psi의 과다한 내부 압력에서 작동될 수 있다. 미국 특허 제4,908,154호는 임의의 유화제가 본질적으로 없는 유화액을 수득하기 위한 미세유체화기의 사용에 대해 개시하고 있다. 다수의 마이크론 미만 크기의 수중유 보조약 제제가 문헌에 개시되어 있다. 미국 특허 제5,376,369호는 신택스 보조약 제제(SAF; Syntax Adjuvant Formulation)로 공지된 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액 보조약 제제를 개시하고 있다. SAF는 오일 성분으로 스쿠알렌 또는 스쿠알란, 유화액 형성 양의 플루로닉 L121(폴리옥시-프로필렌-폴리옥시에틸렌) 블록 중합체 및 면역강화 양의 뮤라밀다이펩타이드를 함유한다. 스쿠알렌은 많은 조직, 특히 상어와 다른 어류의 간에서 발견되는 콜레스테롤의 선형 탄화수소 전구체이다. 스쿠알란은 스쿠알렌의 수소화에 의헤 제조되고, 완전히 포화되어 있다. 스쿠알렌과 스쿠알란 둘모두 물질대사될 수 있고, 우수한 독성학 연구 기록을 갖고 있다. 스쿠알렌과 스쿠알란 유화액은 인간의 암 백신에서 사용되어 왔고, 부작용이 별로 없고, 바람직한 효능을 가졌다. 예를 들면, 앨리슨(Anthony C. Allison)의 문헌[1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93]을 참고할 수 있다. 미국 특허 제6,299,884호 및 국제 특허 공보 제WO90/14837호는 폴리옥시-프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체가 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액의 형성에 필수적이 아님을 개시하고 있다. 더욱이, 이들 문헌은, 비-독성, 대사가능한 오일의 사용을 개시하고 있고, 그들의 유화액 제제에서 광유와 독성 석유 증류 오일의 이용을 명확하게 배제하고 있다. 미국 특허 제5,961,970호는 백신 보조약으로서 사용되는 또다른 마이크론 미만 크기의 수중유 유화액에 대해 개시하고 있다. 이 특허에 개시된 유화액에서, 소수성 성분은 중쇄 트라이글리세라이드 오일, 식물성 오일 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된다. 이 유화액에 포함되는 계면활성제는 천연 생물학적 상용성 계면활성제, 예를 들면 인지질(예를 들면 레시틴) 또는 약학적으로 허용가능한 비-천연 계면활성제, 예를 들면 트윈(TWEEN)-80일 수 있다. 이 특허는 또한, 유화액이 독립적이고 외부에서 형성된 후에 유화액과 항원이 혼합되는 것과는 달리, 유화액이 형성되는 시점에서 항원이 유화액으로 혼입됨을 개시하고 있다. 미국 특허 제5,084,269호는 광유와 조합된 레시틴을 함유하는 보조약 제제가 숙주 동물 내부에서 자극을 감소시키면서 동시에 증가된 전신 면역성을 유도함을 개시한다. 미국 특허 제5,084,269호에서 생성된 보조약 제제는 상표명 암피겐(등록상표, Amphigen)으로 가축용 백신에서 상업적으로 사용되고 있다. 암피겐(등록상표) 제제는 미셀(micelle), 즉 레시틴으로 둘러싸인 오일 소적로 구성되어 있다. 이들 미셀은 종래의 오일계 보조약보다 더 많은 전체 세포 항원이 부착될 수 있게 한다. 더욱이, 전형적으로 10 내지 20%의 오일을 함유하는 보조약을 함유하는 다른 백신 제제와 비교할 때, 암피겐(등록상표)계 백신 제제는 2.5 내지 5%의 낮은 오일 함량의 광유를 함유한다. 이 낮은 오일 함량은 이들 보조약계 백신 제제가 주사 부위에서 피부를 덜 자극하여, 결과적으로 부종이 더 적게 생기고, 도살시 다듬어 낼 부위가 더 적어지게 한다. 또한 오일 소적을 둘러싼 레시틴 코팅이 주사 부위 반응을 추가로 감소시켜, 백신이 안전하고도 효과적이게 한다. 암피겐(등록상표) 제제는 다수의 가축용 백신에서 보조약으로 사용되고, 재구성시 뿐만 아니라, 단기 및 장기 저장 기간동안 백신 제품의 물리적 외형을 유지킬 필요가 있다. 또한, 동결건조된 항원은 주사 직전에 미리 만들어진 보조약 제제와 혼합된다. 이 관행은 수중유 유화액 내에 항원이 균일하게 분포되는 것을 항상 보증하지는 않아서, 유화액의 외형이 바람직하지 않을 수 있다. 더욱이, 정치시, 균질화된 유화액이 상 분리를 나타낼 수 있다. 따라서, 장기간 보관시에 상 분리를 나타내지 않는 안정한 보조약 제제에 대한 필요성이 존재한다. 상분리를 방지하는 한 가지 방법은 소적 크기를 감소시키고, 유화액의 입자 균일성을 증가시키는 것이다. 대사가능한 오일계 유화액 제제의 미세유체화 공정이 기록되어 있지만, 암피겐(등록상표) 제제와 같은 수중유 유화액의 미세유체화는 아직까지 수행되지 않았다.