ＮＡＣ 전사인자의 발현 조절로 향상된 수확량 관련 형질을갖는 식물 및 이의 제조 방법 document_id A220623073111

세계 인구의 증가와 농업에 유용한 경작지의 감소는 농업의 효율성을 증가시키는 연구에 박차를 가하게 만들었다. 작물 및 원예농업 향상을 위한 전통적인 방식은 바람직한 특성을 갖는 식물체를 동정하기 위하여 선택적 육종기법을 이용한다. 그러나, 상기 선택적 육종기법에는 몇 약점이 있는데, 즉 노동집약적이며 양친으로부터 원하는 형질이 항상 전해지는 것이 아닌 이종의 유전적 요소를 갖는 식물로 귀착된다는 것이다. 분자생물학의 진보는 인간이 동물 및 식물의 생식질 (germplasm)을 변형하게 허용했다. 식물유전공학은 유전물질 (전형적으로 DNA 또는 RNA 형태)의 분리와 조작 및 이 유전물질을 식물체 내로 도입하게 했다. 상기 기술은 다양한 향상된 경제적, 농업적, 원예적 형질을 갖는 작물 또는 식물을 제공하는 능력이 있다. 특히 경제적으로 중요한 형질은 증가된 수확량이다. 수확량은 보통 작물로부터 경제적 가치의 측정할 수 있는 산물로 정의된다. 이는 양 및/또는 질의 면에서 정의될 수 있다. 수확량은 몇 요인에 직접적으로 의존되는데, 예를 들면 기관의 수와 크기, 식물체 형상 (예를 들면, 가지의 수), 종자 생산, 잎의 노화 등이다. 뿌리 발달, 양분 흡수, 스트레스 내성, 및 초기 활력 또한 수확량 결정에 중요한 요인일 수 있다. 상기 요인들을 최적화하는 것이 작물 수확량 향상에 기여할 수 있다. 많은 식물의 종자는 인간과 동물의 영양에 중요하므로 종자 수확량이 특히 중요한 형질이다. 옥수수, 벼, 밀, 캐놀라 및 대두와 같은 작물이 종자 자체의 직접적인 소비 또는 가공종자로 육성된 육류 소비를 통해서 전체 인간 칼로리 흡수량의 절반 이상을 차지한다. 상기 작물들은 설탕, 기름 및 산업적 가공공정에 사용되는 많은 종류의 대사물의 재료이기도 하다. 종자는 배 (어린 줄기와 뿌리의 근원) 및 배유 (발아 동안 및 실생의 초기 생장 동안 배의 양분의 공급원)를 포함한다. 종자 발달에는 많은 유전자가 관여되며, 뿌리, 잎 및 줄기로부터 생장하는 종자로 대사물의 이동이 필요하다. 특히 배유는 탄수화물, 오일 및 단백질의 대사 전구체를 동화하여, 이들을 알곡을 채우기 위한 저장성 고분자로 합성한다. 많은 작물에 있어 추가로 경제적으로 중요한 형질은 초기 활력 (early vigour)이다. 초기 활력을 향상시키는 것은 온대 및 열대 벼 품종에 있어 현대 벼 육종의 중요한 목표이다. 긴 뿌리는 물에 파종하는 벼에서는 적절하게 토양에 박히기 위하여 중요하다. 벼를 직접 논에 파종한 곳에서와 식물이 물 밖으로 급속히 나와야 하는 곳에서는 긴 어린 줄기가 강도와 연관되어 있다. 조파지에서는 긴 중배축과 자엽초가 실생이 나오기에 좋다. 초기 활력은 또한 예를 들면, 환경에 보다 잘 적응 (즉, 다양한 생물적 또는 비생물적 스트레스 요인들을 보다 잘 극복하므로)하는 식물로 인한 증가된 식물 적응에 기인할 수 있다. 초기 활력을 갖는 식물은 또한 작물의 보다 나은 정착 (보다 균일하게 자라, 즉 대다수의 식물이 실질적으로 동시에 다양한 발달 단계에 이르는)과 양호한 생장 및 흔히 양호한 수확량을 보여준다. 추가의 중요한 형질은 향상된 비생물적 스트레스 내성이다. 비생물적 스트레스는 대다수 주요 작물의 평균 수확량을 50% 이상 감소시키는 전세계적인 작물 손실의 주요 원인이다 (Wang et al., Planta (2003) 218: 1-14). 비생물적 스트레스는 건조, 염분, 극단적인 기온, 화학적 독성 및 산화적 스트레스에 의해 야기될 수 있다. 비생물적 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 것은 전세계의 농부들에게 매우 경제적 가치가 있는 것이며, 불리한 상황에서 그리고 작물재배가 가능하지 않은 곳에서도 작물재배를 가능하게 한다. 비생물적 스트레스 내성이나 초기 활력을 식물이 갖게 하는 것은 종자 수, 종자 량, 종자 발달, 종자 충전 또는 임의의 기타 종자 관련 다른 형질을 통해, 식물 종자 수확량을 증가시키는 것으로 농업에 매우 중요하다. 관상식물 생산, 수목재배, 원예, 및 삼림을 포함한 농업에 있어 많은 응용분야는 제외하고, 수확량 증대는 생물반응기 (약제, 항체 또는 백신 같은 물질의 생물공학적 생산 또는 유기 폐기물의 생물학 전환을 위해서) 및 기타 영역에서 사용을 위한 조류의 생산에서처럼 많은 비농업적 용도가 있다. 전사인자는 서열 특이적 DNA 결합을 보여주며, 전사를 활성화 및/또는 억제할 수 있는 단백질로 일반적으로 정의된다. 아라비돕시스 게놈은 평가된 전체 유전자 수의 약 5.9%에 해당하는 적어도 1533 개 전사 조절자를 코딩한다. 이들 전사인자 중 약 45%는 식물에 특이적인 패밀리인 것으로 보고된다 (Riechmann et al., 2000 (Science Vol. 290, 2105-2109)). 본 발명은 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 특정 유형의 NAC 전사인자의 용도에 관한 것이다. NAC는 NAC 도메인, 즉 NAM (no apical meristem), ATAF1,2 및 CUC2 (cup-shaped cotyledon)를 포함하는 것으로 최초로 기재된 세가지 유전자의 이름으로부터 유래된 두문자어이다. NAC 단백질은 식물에 널리 있으며, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 게놈에는 적어도 백 개의 NAC를 코딩하는 유전자가 있을 것으로 평가되나, 다른 진핵생물에서는 보고된 바가 없다 (Riechmann et al., 2000). NAC 단백질 패밀리는 고도로 보존된 N-말단 NAC 도메인과 다양한 C-말단 도메인의 존재로 동정되는 다양한 식물 단백질을 포함한다. NAC 단백질의 DNA-결합 능력은 일반적으로 NAC 도메인에 한정되어 있으며, C-말단 영역은 전사 활성화 도메인을 구성한다. 몇가지 NAC 유전자는 호르몬에 의하여 유도됨이 밝혀졌다. NAC 도메인은 또한 바이러스 단백질과 RING 핑거 단백질 같은 다른 단백질과의 상호작용에 관련되어 있다. NAC 단백질은 또한 어린 줄기 정단 분열조직과 꽃 기관의 발달, 및 측근 형성 같은 다양한 식물과정에 있어 전사조절에 연관되어 있다. NAC 단백질은 또한 스트레스 및 바이러스 감염에 대한 반응에 연관되어 있다 (Ernst et al., 2004, EMBO Reports 5, 3, 297-303). 미국 특허 제6,844,486호는 애기장대로부터 분리된 NAC 패밀리의 구성원인 NACI에 대해 기술하고 있다. NACI는 자엽과 측근 발달의 조절에 관여되는 것으로 보고되었다. nacI 유전자의 과발현은 야생형에 비하여 보다 큰 뿌리와 긴 측근을 갖는 보다 큰 식물체를 만드는 것으로 보고되었다. 놀랍게도 특정 유형의 NAC 전사인자를 코딩하는 핵산을 식물체 내에서 발현을 조절하면 대조구 식물에 비하여 향샹된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공한다는 것을 밝혔다. 식물에 있어 수확량 관련 형질을 향상시키는데 적합한 특정한 종류의 NAC 전사인자에 대하여 하기에 상세히 기재된다. 본 발명은 특정 유형의 NAC 전사인자를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현을 조절하는 것을 포함하는, 대조구 식물에 비하여 식물에 있어 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 식물에 있어 수확량 관련 형질을 향상시키기 위한, Apetala 유형의 전사인자인 AP2-2의 용도에 관한 것이다. AP2 (APETALA2) 및 EREBPs (에텔렌 반응성 요소 결합 단백질 (ethylene-responsive element binding proteins), 또는 ERF (에텔렌 반응 인자)는 식물에 유일한 전사인자 패밀리의 원형적인 구성원으로, 이의 특징은 AP2 DNA-결합 도메인을 포함한다는 것이다. AP2/EREBP 유전자는 큰 다중유전자 패밀리 (multigene family; AP2/ERF 수퍼패밀리)를 이루며, 꽃 기관 정체성(identity) 결정 또는 잎 표피세포 정체성 조절 같은 몇가지 발달과정에서의 주요 조절자인 것에서부터 다양한 유형의 생물적 및 환경적 스트레스에 반응하기 위하여 식물이 사용하는 기작의 일부를 이루는 것에 이르기까지 식물의 생활사에 있어 다양한 역할을 한다. AP2/ERF 수퍼패밀리 내에 세 개의 큰 패밀리가 구분되는데, 두개의 AP2/ERF 도메인을 갖는 AP2 패밀리, 하나의 AP2/ERF 도메인을 갖는 ERF 패밀리 및 B3-형 DNA-결합 도메인을 함유하는 RAV 패밀리이다. Nakano 등 (Plant Physiology 140, 411-432, 2006)는 아라비돕시스와 벼에서 ERF 유전자 패밀리 연구로 아라비돕시스 ERF 유전자 패밀리는 12 개의 그룹으로 (그룹 I 에서 X, 그룹 VI-유사 및 그룹 Xb-유사), 벼의 경우 15 개의 그룹으로 구분하였다. 아라비돕시스 그룹 VII 단백질은 보존된 N-말단 모티프를 갖는 것이 특징으로 보존된 모티프 VII-1 (CMVII-1)라 한다. 벼에 있어서는 그룹 VII이 아라비돕시스 그룹 VII보다 많은 단백질을 포함하며, 벼와 아라비돕시스 그룹 VII 간에 공통적인 많은 보존된 모티프들이 있기는 하나 전형적인 CMVII-1 모티프가 없다는 점에서 벼 그룹 VIIb가 별도로 생성되었다. 기능적으로, 그룹 VII의 구성원들은 삼투 스트레스 및 질병 반응 (예를 들면, WO 2003007699에서)에 관여되는 것으로 기재된다. 담배에서 토마토 JERF3의 이소성(ectopic) 과발현은 형질전환체의 염분 내성을 증가시켰으며 (Wang et al., Plant Molecular Biology 58, 183-192, 2004), 고추 전사인자 CaPF1의 과발현은 소나무에서 삼투 내성을 증가시켰으며 (Tang et al., Plant Cell Rep. 26, 115-124, 2007), 아라비돕시스에서 병원균 저항성을 증가시켰다 (Yi et al., Plant Physiol.136, 2862-2874, 2004). 보리 HvRAF에 대해서도 유사하게 관찰되었다 (Jung et al., Plant Epub 26 August 2006). 더욱이, 그룹 VII 형 ERF 단백질은 메티오닌 생산 과정에 사용되었다 (EP2005003297). 놀랍게도, 그룹 VII ERF 단백질 (이후 AP2-2 폴리펩티드라 함)을 코딩하는 핵산의 식물체에서의 발현 조절은 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공한다는 것을 밝혔다. 이 향상된 수확량 관련 형질은 증가된 스트레스 저항성으로 인한 것은 아니었다. ERF (Ethylene Response Factor) 패밀리는 전사인자의 큰 유전자 패밀리이며, AP2 및 RAV 패밀리를 포함하는 AP2/ERF 수퍼패밀리의 일부이다. AP2/ERF 수퍼패밀리는 약 60 내지 70 개의 아미노산으로 구성되며 DNA 결합에 관여하는 AP2/ERF 도메인에 의해 정의된다. 이들 세 패밀리는 다음과 같이 규정되어 왔다. 두개의 반복된 AP2/ERF 도메인을 포함하는 단백질의 AP2 패밀리, 하나의 AP2/ERF 도메인을 포함하는 단백질의 ERF 패밀리 및 하나의 AP2/ERF 도메인 외에, VP1/ABI3를 포함하는 다른 식물 특이적 전사인자에서 보존된 DNA-결합 도메인인 B3 도메인을 포함하는 단백질의 RAV 패밀리이다. ERF 패밀리는 때로 두 주요 서브패밀리로 세분되며, ERF 서브패밀리 및 CBF/DREB 서브패밀리이다. ERF 패밀리에서의 122 개의 유전자를 포함하여, 아라비돕시스 게놈의 AP2/ERF 수퍼패밀리에서 147 개의 유전자가 동정되었다. AP2 도메인은 꽃 발달에 관여되는 아라비돕시스 (Arabidopsis thaliana) AP2 단백질 내의 반복된 모티프로서 최초로 동정되었다 (Nakano et al., 2006, Plant Physiol. Vol. 140, pp.411-432). Nakano 등 (2006)은 AP2 패밀리의 유전자들이 예를 들면, 꽃발달, 작은 이삭(spikelet) 분열조직 결정(determinacy), 잎 표피세포 정체성 및 배 발달 같은 발달과정의 조절에 관여하는 것으로 보여진다고 보고하였다. ERF 패밀리의 몇가지 단백질들이 동정되었으며, 호르몬 신호 전달, 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 반응, 및 대사조절과 같은 세포 과정 및 다양한 식물 종에 있어서 발달 과정에 있어서의 많은 다양한 기능에 연관된다. 놀랍게도, AP2-70-유사 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절이 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공한다는 것이 발견되었다. 식물에 있어 수확량 관련 형질 향상에 유용한 것으로 본 발명에서 기재된 AP2-70-유사 폴리펩티드는 Nakano 등 (2006)의 분류체계에 따라 그룹 Ib (A-6)로 분류된다. Nakano는 그룹 Ib의 구성원인 옥수수 (Zea mays)의 DBF1이 일시적으로 형질전환된 옥수수 캘러스에서 ABA-반응성 rab17의 가뭄-반응성 인자 2 (drought-responsive element 2, DRE2) 의존성 전사를 활성화하는 것으로 보인다고 보고하였다. 또 다른 그룹 Ib의 구성원인 알팔파 (Medicago truncatula) WXP1에 있어서는 이의 과발현이 형질전환 알팔파에서 왁스 생산을 활성화하는 것으로 보고되었다.