사이토졸 내로의 바이러스 매개된 분자 전달을 위한 광화학적 내부이행 document_id A220623073210

유전자 요법, 즉 질병을 해결하기 위한 환자의 세포의 유전적 변형은 각종 질병, 예를 들면 암, 바이러스 및 세균성 감염을 비롯한 감염성 질병, 심혈관 질병, 낭포성 섬유증과 같은 선천성 유전 질환, 면역계 질환 및 많은 기타 질환을 치료하는데 큰 치료 가능성을 갖는 것으로 인식되고 있다. 그러나, 유전자 요법의 임상적 개발은 여전히 많은 미해결된 문제점에 직면하고 있으며, 그 중에서도 가장 중요한 것 중의 하나는 치료 유전자를 생체내에서 표적 세포로 효율적이고 특이적으로 전달하는 방법을 찾는 것이다 (Verma 0026# Somia, 1997, Nature, vol. 389, 239-242 and Anderson, 1998, Nature vol. 392, 25-30). 유전자 요법은 많은 다른 가능한 접근법을 포함할 수 있으며 클로닝된 인간 유전자 또는 유전자 세그먼트, 이중 가닥 인간 유전자 또는 유전자 세그먼트, 다른 게놈 및 유기체로부터의 유전자, 올리고뉴클레오티드 및 각종 인공 유전자 또는 안티센스 유전자와 같은 그의 단편을 포함할 수 있다. 통용되는 방법에서, 많은 다른 캐리어 또는 벡터가 유전자 요법에서 유전자 전달하는데 사용하기 위해 제안되어 왔다. 폴리양이온성 화합물의 예로서, 양이온성 지방 및 바이러스 시스템이 언급될 수 있지만, 지금까지는 생체내 유전자 요법이 거의 성공되지 못하였다. 통용되는 방법의 많은 알려진 결점 중에는 벡터의 낮은 혈청 안정성, 유전자 전달에서의 제한된 특이성, 유전자 전달에서의 낮은 효율 등이다. 바이러스 캐리어의 사용은 다른 방법에 비해 증강된 전달에 의해 상쇄되지 않는 염증과 같은 부작용을 일으킬 수 있는 바이러스 요소가 숙주 내로 도입되므로 특별히 주의하며 접근되어야 한다. 대부분의 분자들은 세포막을 용이하게 투과하지 못한다. 분자를 생세포의 사이토졸 내로 도입시키는 방법은 기술업계에 공지되어 있으며 생물학적 과정을 조작하고 연구하는데 유용한 도구이다. 오늘날 가장 통상적으로 이용되는 방법에는 미량주사, 적혈구 고스트-매개된 융합 (fusion) 및 리포좀 융합, 피노솜 (pinosome)의 삼투성 용해, 스크레이프 로딩 (scrape loading), 일렉트로포레이션 (electroporation), 인산칼슘 및 바이러스-매개된 트랜스펙션 (transfection)이 있다. 이들 기술은 많은 경우에 비실용적이고 시간이 걸리며 비효율적이거나, 상당한 세포사를 야기시킬 수 있지만, 이들은 배양물 중의 세포를 조작하는데 유용하다. 따라서, 이러한 기술은 생물학적 또는 의학적 연구에서 또는 치료법에서 사용하는데 최선의 것은 아니며, 이러한 용도에서 그 기술은 종종 충분히 효율적이지 않으며, 허용되지 않는 독성 효과를 가질 수 있거나 기술적인 이유로 이용가능하지 않을 수 있다. 포르피린 및 그밖의 다수의 다른 광감작성 화합물이 세포 및 조직에 대하여 세포독성 효과를 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이들 효과는, 광감작성 화합물을 광선에 대해 노출시키면 독성이 될 수 있거나, 세포 및 세포 구조물의 막을 포함한 세포성 물질 또는 생체분자를 손상시키는 단일항 (singlet) 산소 또는 그밖의 다른 산화 성분과 같은 독성 물질을 방출시킬 수 있으며, 이러한 세포 또는 막 손상은 결국 세포를 사멸시킬 수 있다는 사실에 근거한 것이다. 이들 효과는 특히 종양성 질병을 포함하는 다양한 비정상 상태 또는 질환의 치료에 이용되어 왔다. 이러한 치료는 광역학적 요법 (PDT)이라고 부르며, 신체의 병소 부위에 광감작제 (광화학요법제)를 투여하고, 이어서 광감작제를 활성화시키고 그것을 세포독성 형태로 전환시키기 위해서 광활성화 광선에 노출시킴으로써 병소 세포를 사멸시키거나 이들의 증식 잠재성을 감소시키는 것을 포함한다. 목적하는 표적 부위, 예를 들어 종양 또는 다른 병소에 우선적으로 또는 선택적으로 집적되는 광감작제가 공지되어 있다. 특히 프소랄렌, 포르피린, 클로린 및 프탈로시아닌을 포함하는 다양한 광감작제가 공지되어 있다. 이러한 약물은 광선에 노출되면 독성으로 된다. 포르피린 광감작제는 독성 산소 성분의 생성을 통해 간접적으로 작용하며, PDT를 위한 특히 바람직한 후보물질인 것으로 간주된다. 포르피린은 헴 (heme)의 합성시에 천연적으로 발생되는 전구체이다. 특히, 헴은 효소인 페로킬레이타제 (ferrochelatase)의 작용에 의해서 철 (Fe3+)이 프로토포르피린 IX (PpIx) 내에 통합될 때 생산된다. PpIx는 매우 강력한 광감작제인 반면에 헴은 광감작 효과를 갖지 않는다. 다양한 포르피린계 또는 포르피린-관련 광감작제가 본 기술분야에서 공지되어 있으며 문헌에 기술되어 있다. 세포독성 효과는 주로 단일항 산소의 형성을 통해서 매개된다. 이 반응성 중간체는 세포내에서 매우 짧은 수명을 갖는다 (003c#0.04 μs). 따라서, PDT의 일차적인 세포독성 효과는 광선 노출 중에 1O2의 형성 부위에 매우 인접해서 발휘된다. 1O2는 단백질 (히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 시스테인, 티로신), DNA (구아닌), 불포화 지방산 및 콜레스테롤과 반응하여 이들을 산화시킨다. PDT의 이점 중의 한가지는 광선에 노출되지 않는 조직은 영향받지 않고 유지된다는 점, 즉 선택적 PDT 효과를 얻을 수 있다는 점이다. 원치 않는 세포 집단, 예를 들어 종양 세포를 파괴하기 위해서 PDT를 사용하는데 관한 다양한 문헌이 있다. 특허 문헌에는 단독으로 사용되거나 또는 표적화제 (targeting agent), 예를 들어 종양 세포 수용체 결정인자에 대해 지향되는 면역글로불린과 콘쥬게이트되어 더욱 세포 특이적인 복합체를 형성하는 다수의 광역학적 화합물이 기술되어 있다. 헤마토포르피린 유도체와 같은 특정의 광화학적 화합물은 더구나 악성 세포에 집적되는 고유의 능력을 갖는다. 이러한 방법 및 화합물은 노르웨이 특허 제173319호 및 노르웨이 특허 출원 제90 0731, 176 645, 176 947, 180 742, 176 786, 301 981, 30 0499 및 89 1491호에 기술되어 있다. 따라서, 이러한 PDT 방법은 세포사를 유도하는 세포 구조물의 파괴에 의존적이다. WO 96/07432 또는 동시 계류중인 출원 WO 00/54802는 막-불투과성인 분자를 광범위한 세포 파괴 또는 세포사를 일으키지 않으면서 세포의 사이토졸 내로 도입시키는 기전으로서 광역학적 효과를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 내부이행될 분자 및 광감작성 화합물은 동시에 또는 순차적으로 세포에 가해지고, 이때에 광감작성 화합물 및 분자는 엔도좀, 라이소좀 또는 그밖의 다른 세포내 막으로 한정된 구획으로 세포내이입되거나 또는 다른 방식으로 전위된다. 전위될 분자 및 광감작성 화합물은 함께 또는 순차적으로 (바람직하게는, 개별적으로 또는 순차적으로) 세포에 가해져서 세포에 의해 함께 동일한 세포내 구획 내로 흡수된다 (즉, 공동-전위된다). 세포 내에 내부이행될 분자의 방출은, 그후에 광감작성 화합물을 활성화시키는데 적합한 파장의 광선에 세포를 노출시키고, 이는 다시 세포내 구획 막을 붕괴시키고 이어서 광감작제와 동일한 구획 내에 위치하는 분자를 사이토졸 내로 방출시키는 것으로 이루어진다. 이러한 방법은 "광화학적 내부이행 (internalization)" 또는 PCI라고 불리운다. 따라서, 이 방법에서 세포를 광선에 노출시키는 최종 단계는 당해 분자가 광감작제와 동일한 세포내 구획으로부터 방출되어 사이토졸 내에 존재하도록 한다. 이 방법을 효과적인 것으로 만들기 위해, 광선 조사가 이루어질 때 사이토졸 내로 방출될 분자 및 광감작성 화합물 둘다가 동일한 세포내 구획 내에 존재하는 것이 필수적인 것으로 생각되었다. 그러나, 세포를 광선에 노출시키는 것이 반드시 최종 단계는 아니며 전달 분자 및 광감작제가 광선 노출 시에 동일한 세포내 구획 내에 위치하는지에 좌우되지 않는 유사한 PCI 방법에 의해 분자가 세포의 사이토졸 내로 도입될 수 있음이 밝혀졌다. 그러한 방법에서는, 내부이행되어 사이토졸로 전달될 분자가 세포와 접촉하게 되기 전에 광감작제가 세포와 접촉되고 조사에 의해 활성화될 수 있다. 따라서, 내부이행될 분자 및 광감작제가 광선 노출시에 반드시 동일한 세포내 구획 내에 위치하는 것이 아니라는 사실에도 불구하고, 분자는 여전히 세포로 유입되고 사이토졸로 전달된다. 이러한 결과는 복사본이 첨부되어 있으며 본원에 참고로 삽입된, 동시 계류 중인 국제 출원 (The Norwegian Radium Hospital Research Foundation의 명의로 2001년 11월 29일에 출원된, 발명의 명칭 "Method"인 출원)에 상세히 설명되어 있다.