理中湯이 Mite antigen으로 유발된 NC/Nga 생쥐의 아토피 피부염에 미치는 영향 document_id A220623243380

본 연구의 목적은 RBL-2H3 비만세포를 이용한 in vitro 실험과 NC/Nga 아토피 피부염 생쥐를 이용한 in vivo 실험을 통해 이중탕이 아토피 피부염에 미치는 영향을 조사하기 위해 이루어졌다. In vitro에서 real time PCR을 이용하여 IL 4, IL 13 mRNA 유전자 발현을 측정하였으며, ELSA를 이용하여 IL 4, IL 13 생산을 분석하였다. 또한, GATA 1, GATA 2, NF AT1, NF AT2, AP 1와 NF κB 같은 전사인자의 발현을 western blotting으로 분석하였다. 그리고 In vivo에서 임상피부점수표, NC Nga 아토피 피부염 쥐의 혈액학, 혈청 total IgE와 IgG1를 평가하고 NC Nga에서의 염증 정도, 총 세포 숫자, 액와림프절의 면역조직화학적 염색과 조직학적 소견, 배액림프절, 말초혈액의 단핵세포, 배부 피부 조직을 분석하였다. YJT는 IL 4, IL 13 mRNA의 발현과 IL 4, IL 13의 생산을 감소시켰으며, GATA 2, NF AT2, c Fos와 NF κB을 포함한 비만세포의 특정 전사 인자의 발현을 유의하게 감소시켰다. YJT의 경구투여는 피부강도점수를 감소시켰다. 또한, YJT의 경구투여는 혈청 내 L 5, IL 13, histamine, IgE와 같은 염증세포를 감소시켰다. YJT의 경구투여는 비장세포 배액 상층액에서 IFN gamma를 상승시켰다. YJT의 경구투여는 말초혈액 단핵세포에서의 CD3e^+, CD19^+, CD4^+, CD8^+, CD3e^+, CD69^+ CD11b^+Gr-1^+, CCR3^+, 액와림프절에서의 CD4^+, CD8^+, CD3e^+CD69^+, B220^+CD23^+, 배부 피부 조직에서의 CD4^+, CD11b^+Gr-1^+의 세포 수를 감소시켰다. 조직학적 실험에서는 YJT의 경구투여로 인해 아토피 피부염이 유도된 NC Nga 쥐의 피부에서 염증세포의 침투가 많이 향상되는 것을 보여주었다. YJT의 항알레르기 역할이 비만세포에서의 GATA 2, NF AT2, NF κB와 같은 전사인자 조절을 통해 IL 4, IL 13과 같은 Th2 세포의 하향조절을 함으로써 치료할 수 있을 것으로 사료된다. YJT는 분자 매개물과 면역세포를 조절하여 NC Nga 쥐에서 유도된 아토피 피부염과 기능적으로 관련되어 있으며 아토피 피부염의 증상을 회복하는데 중요한 역할을 할 것이다. 알레르기란 정상적인 경우 인체에 해를 끼치지 않는 물질에 대해 면역 체계가 이상반응을 일으키는 것을 말한다. 아토피 피부염은 알레르기성 질환의 대표적인 것으로 심한 소양감, 홍반, 부종, 삼출, 가피, 인설, 태선화 등을 특징으로 하며 그 발병률은 전 인구의 약 10 20% 정도로 보고되고 있다. 주로 유아와 소아에 발생하고 대개 5 세 이전에 90% 정도가 발병하며 일반적으로 나이가 증가할수록 유병율이 감소한다고 알려져 있으나 전체적 유병률은 증가하는 추세이고 점차 중증화되고 만성화되는 경향을 보이고 있어 사회적 관심이 되고 있다. 아토피 피부염의 원인은 아직 뚜렷하게 밝혀진 바가 없으나 유전적 요인, 환경적 요인과 함께 면역학적 기능 이상이 복잡하게 연관되어 발생하는 것으로 추측되고 있다. 아토피 피부염에 유전적 요인이 작용함은 이미 여러 연구에서 밝혀진 바 있으며, 이는 아버지가 아토피 피부염이 있는 경우 자녀의 아토피 피부염 발생률은 66.6%, 어머니가 아토피 피부염이 있는 경우 자녀의 아토피 피부염 발생률은 70.0%에 육박한다고 보고하였고, 원인 유전자에 대해서는 IL 4 promoter 혹 IL 4 수용체의 변이 등이 제시되고 있다. 환경적으로는 산업화로 인한 각종 공해 및 부모, 주거 환경, 식생활 등의 수많은 유인들이 아토피 피부염의 위험을 증가시킨다. 면역학적으로 아토피 피부염은 IgE의 과잉 생성, 비만세포와 대식세포의 과활성화, 호산구 증가 등과 관련이 있으며 Th1 반응과 Th2 반응의 불균형이 아토피 피부염을 일으키는 핵심 요인으로 보고되고 있다. 알레르기 반응의 기전에 중요하게 관여하는 T 세포의 표면 항원 수용체를 T 세포 수용체라 하며 TCR은 다시 TCR1과 TCR2로 구별되고 그 중 TCR2를 가진 T 세포는 CD4+인 보조 T 세포와 CD8+인 세포독성 T 세포로 나뉜다. 아토피 피부염 피부 병변의 주된 구성은 CD4+ T 세포로 나타나며 이는 생성되는 사이토카인의 종류에 따라 Th1 세포와 Th2 세포로 구분된다. Th1 세포는 IFN γ, IL 2, TNF를 생산하며 주로 지연형 과민반응을 조절하고 Th2 세포는 IL 4, IL 5, IL 10, IL 13, IL 16 등 일련의 사이토카인을 분비하여 IgE와 호산구, 비만세포에 의한 면역반응을 촉진하여 알레르기 반응에 관여한다. IL 4는 림프구의 성숙과 면역글로불린의 생성에 밀접한 관계가 있으며 IL 5는 호산구의 분비, 분화와 성숙에 밀접한 연관이 있다. 최근의 연구들에서는 알레르기 반응에 있어 Th2 세포의 활성화에 연이은 Th1 세포의 활성화도 가정되고 있다. 즉, 아토피 피부염의 급성기에는 주로 Th2 세포에 의해 사이토카인 IL 4, IL 5, IL 13이 생산되지만, 만성기에는 Th2 세포 보다는 Th1 세포에 의해 사이토카인이 발현되는 경향을 보여 아토피 피부염은 항원에 대한 Th2 세포 반응이라는 추측은 전적으로 옳지 않으며 Th1 세포 반응도 유발될 수 있다. 그러나 아토피 피부염의 초기 반응은 Th2 세포 반응이 관여하기 때문에 초기에 Th1 세포 반응으로 전환시키는 것은 병변의 호전을 위해서 도움이 될 수 있다. Th1 세포와 Th2 세포에서 특이하게 발현되는 사이토카인은 역관계를 나타낸다. 즉 Th1 세포가 생산하는 IFN γ에 의해 Th2 세포에서 IL 4, IL 5 생산이 억제되고, Th2 세포가 생산하는 IL 4, IL 5 등은 Th2 세포의 Th1 및 Th2 분화에 중요한 역할을 하는 전사인자에는 T box expressed in T cells, STAT 1, STAT 4, STAT 6, GATA binding protein 3, c maf 등이 알려져 있는데, T bet, STAT 1, STAT 4 등의 전사인자가 활성화되면 Th1 림프구로의 분화가 촉진되고, STAT 6, GATA 3, c maf, NFAT 등의 전사인자가 활성화되면 IL 4 등의 사이토카인과 함께 Th2 림프구로의 분화를 촉진한다. 비만세포는 신체의 거의 모든 조직에 존재하지만 주로 외부 환경과 접하는 부분, 즉 피부, 내장 및 호흡기에서 많이 발견되며, 알레르기 반응기간 동안 생리적인 변화를 유발하는 중심인자로 인식되고 있다. 비만세포는 interleukin 3와 granulocyte macrophage colony stimulating factor의 효과에 의존하면서 발달한 후 성숙세포로서 골수에서 생산되는 것으로 생각되며 세포질 내에 과립을 풍부하게 가지고 있다. 항원이 신체에 들어오면 수지상세포, 대식세포, B세포 등과 같은 항원제시세포가 항원을 포식하여 MHC II와 함께 세포 표면에 노출하게 되고 특히 기생충이나 알레르기 유발물질이 항원으로 작용하면 B 세포가 활성화되어 항원 특이적 IgE가 생성되고 이 IgE가 비만세포의 세포막에 있는 고친화성 IgE 수용체에 결합하는데 이러한 반응을 비만세포의 감작이라고 부른다. 감작된 비만세포에 항원이 노출되면 항원이 비만세포 막에 있는 IgE에 결합하여 IgE를 교차결합시키게 되고 이로 인해 비만 세포가 활성화되어 탈과립이 발생하여 여러 가지 물질들이 방출된다. 비만세포는 과립내의 화학 매개체와 사이토카인을 분비하면서 염증반응에 관여하는데 히스타민은 비만세포의 과립으로부터 가장 빠르게 유리되며 가장 많이 유리되는 화학 매개체로 말초혈관에 대한 투과성 항진과 확장작용, 기관지 평활근에 대한 수축작용, 점막 표면에 대한 선상세포의 분비 항진 작용 등을 나타내어 과민반응 및 만성 염증반응을 일으켜 알레르기 반응에 중요한 작용을 한다. 또한 비만세포는 IL 4, IL 13과 같은 Th2 사이토카인을 분비하여 알러지 반응을 확장하는 역할을 하는데, IL 4는 비만세포에서 선택적으로 발현되는 GATA 1, GATA 2, PU.1와 같은 인트론 부위에 결합하는 전사인자에 의해 특이적으로 조절되며, IL 13은 NFAT, GATA, AP 1을 포함하는 여러 전사 인자와의 협동에 의해 조절된다. 비만세포는 이외에도 다양한 사이토카인을 생산 분비하게 되는데 IL 3, IL 5, IL 6, IL 8, IL 10, IL 16, tumor necrosis factor α, vascular permeability factor vascular endothelial cell growth factor, Granulocyte macrophage colony stimulating factor, stem cell factor, basic fibroblast growth factor, monocyte inhibitory protein 1α등이 포함된다. 본 실험의 결과를 살펴보면, In vitro 실험에서 hFCs를 배양하여 YJT의 세포독성을 측정한 결과 모든 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, YJT가 비만세포에서 IL 4와 IL 13 mRNA 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 RBL 2H3 비만세포에 CsA와 다양한 농도의 YJT를 처리한 후 비만세포를 활성화 시키기 위해 PMA와 ionomycin로 자극한 뒤 6시간 후 real time PCR로 mRNA 유전자 발현을 분석한 결과, 대조군에 비하여 CsA를 처리한 양성대조군과 YJT를 처리한 실험군 모두에서 유전자 발현이 유의성 있게 억제되었고, YJT가 비만세포에서 IL 4와 IL 13 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RBL 2H3 비만세포에 CsA와 다양한 농도의 YJT를 처리한 후 PI로 자극한 뒤 24시간 후 ELISA로 분석한 결과, CsA를 처리한 양성대조군과 YJT를 처리한 실험군 모두에서 IL 4와 IL 13의 생성이 유의성 있게 억제되었다. Th2 사이토카인 발현은 비만세포에서 선택적으로 발현되는 GATA 1, GATA 2, NF AT, AP 1, NF κB p65 등의 전사인자에 의해 특이적으로 조절되므로 YJT가 Th2 사이토카인 발현을 억제하는 조절 메커니즘을 연구하기 위해 western blot으로 대조군, CsA를 처리한 양성대조군, 10 ㎍ ㎖와 100 ㎍ ㎖의 YJT를 처리한 실험군을 비교 분석한 결과, GATA 1의 단백질 발현은 대조군에 비하여 실험군에서 약간 억제되었고, GATA 2의 경우 보다 많이 억제 되었다. GATA 1은 조혈모세포로부터 비만세포로의 발달에 관여하며, Stem cell factor와 GM CSF가 있는 조건에서 GATA 1 또는 GATA 2가 발현되면 호산구가 생성되는데 동물 실험에서 GATA 1 결합 부위를 소실시켰을 때 호산구 계열이 소실되는 현상을 보인 연구 결과는 GATA 1이 호산구 생성과 발달에 중요한 역할을 함을 시사한다. NF AT는 활성화된 면역세포들에서 면역반응의 유도와 조절에 필수적인 여러 사이토카인 유전자 및 세포 표면인자 등의 발현에 중요한 역할을 하는 전사조절인자이며, 비만세포에서 IL 4와 IL 13 유전자 발현은 선택적으로 발현되는 NF AT1, NF AT2와 같은 인트론 부위에 결합하는 전사인자에 의해 특이적으로 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 실험 결과, NF AT1 단백질 발현은 100 ㎍ ㎖ YJT 처리한 실험군에서는 억제되었으나 10 ㎍ ㎖ YJT 처리한 실험군에서는 대조군과 차이가 없었으며 NF AT2의 경우 10 ㎍ ㎖, 100 ㎍ ㎖ YJT 처리한 실험군 모두, 대조군에 비하여 억제되었다. 비만세포에서 PI과 관련된 여러 형태의 인자는 T 세포의 NFAT와 같지 않을 가능성이 있다. NF AT와 근접해 있는 OAP와 MARE는 T 세포 특이적 조절 부분이고 OAP는 AP 1, MARE는 c maf 결합 부위이다. GATA 2는 IL 13에 결합하는 AP 1 결합을 유도 할뿐만 아니라 비만세포에서 IL 13 생성을 증가시킨다. c Jun과 c Fos는 AP 1 단백질 복합체의 중요한 구성원으로서 heterodimer이며 AP 1 결합 부위를 통해 전사를 조절한다. 본 실험 결과, c Jun 및 p c Jun의 단백질 발현은 대조군과 실험군이 차이를 보이지 않았으나 c Fos의 경우 10 ㎍ ㎖, 100 ㎍ ㎖ YJT 처리한 실험군 모두, 대조군에 비하여 현저히 억제되었다. GATA 3는 염색체의 구조를 느슨하게 만들어 유전자의 발현을 크게 증가시키는 기능을 가진 조직 특이적으로 발현되는 전사인자로서 T 세포에서 IL 13을 발현하는데 있어서 중요한 역할을 하며 IL 4, IL 5의 발현에도 영향을 미친다. 또한 GATA 3는 T 세포에서 STAT6와 NF κB p65의 활성화를 필요로 하며, 이 세 요소가 결합하여 IL 13 유전자 프로모터의 전사적 활성화를 촉진한다. NF κB는 p50과 p65라는 2개의 subunit으로 구성된 다단백질 복합체이며 inhibitor of NF κB라고 불리는 억제성 단백질의 결합으로 불활성화 상태를 유지하다가 자극에 의해 해리되면 핵내로 이동하여 특정한 유전자의 promoter 부위에 결합함으로써 유전자의 전사를 활성화시킨다. 실험 결과, NF κB p65 단백질 발현은 대조군에 비하여 100 ㎍ ㎖ YJT 처리한 실험군에서 현저히 억제되었다. 이는 YJT가 비만세포의 알레르기 반응으로의 분화 및 활성을 억제하고 관련 유전자 발현을 선택적으로 조절하여 항알레르기의 효과가 있음을 나타내는 것으로 보인다. 본 실험에 사용된 NC Nga 생쥐는 태어난 후 어렸을 때부터 일반사육환경에서 노출되어 자라게 되면 12주령 이상에서 사람에서 나타나는아토피 피부염과 유사한 병변인 딱지가 앉는 상처 및 작은 가피의 병변이 관찰되는 동물로서 아토피 피부염 모델동물로 사용되고 있다. In vivo 실험 결과를 살펴보면 진드기 항원으로 피부염을 유발한 대조군에 비하여 YJT를 투여한 실험군에서 홍반, 부종, 인설, 가피, 미란, 태선화 등의 제반 증상이 현저하게 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 일반적으로 WBC는 말초혈액에서 외부항원에 대한 면역기능을 갖는데 아토피 환자 말초혈액에서 WBC 수는 granulocyte 세포수가 증가하면서 함께 증가한다. Neutrophil은 2 6%로 세균이 침입하는 즉시 극적으로 증가하여 대식세포와 함께 다양한 세균들의 표면에 있는 공통성분을 인지, 결합하여 식세포 작용을 하며, 사이토카인을 분비하고, Eosinophil은 1 5%로 피부나 호흡기도의 내벽과 같이 외부에 접해있는 부위에 다량 군집되어 외부로부터 체내로 들어오는 독성 물질을 해독하는데 중요한 역할을 한다. 최종 관능평가 후 혈액을 채취하여 분석한 결과 WBC 수는 대조군에 비하여 YJT을 투여한 실험군에서 2배 이상 감소하였으며, Neutrophil과 Eosinophil의 비율도 대조군에 비하여 각각 2배 이상, 3배 이상 감소하였다. IgE는 B 세포의 분화되는 과정에서 분비되어 염증반응을 유도하고 IgG1은 Th2 세포에서 분비되어 B 세포의 분화를 촉진하는 IL 4에 의하여 유도되고 B 세포 분화 중 IgE 생산과 관련되어 증가한다. 본 실험 결과, YJT을 투여한 실험군에서의 혈청 중 IgE 수준은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고 IgG1 수준도 감소하였다. 이러한 결과는 YJT가 NC Nga 생쥐의 B 세포 알레르기 반응을 억제하여 B 세포 분화에 수반되는 IgE 수준을 억제한 것으로 보이며 이로 인해 IgG1의 수준도 감소된 것으로 생각된다. Th2 세포에서 분비되는 IL 4는 면역글로블린 생성시 IgE로 분화를 유도하고 유착분자들을 활성화시켜 단핵구나 호산구 등 염증세포들을 염증이 일어나는 조직 세포로 이동하게 하고, IL 5는 호산구의 증식과 활성화를 유도하는 기능이 있으며, IL 13은 IgE 생산을 자극한다. 본 실험 결과, YJT투여군은 대조군에 비하여 IL 5와 IL 13, histamine 수준이 감소하였으나 유의성은 IL 5만이 나타났으며, YJT투여군에서는 대조군에 비하여 IL 5, IL 13, histamine 수준이 모두 유의성 있게 감소하였다. 또한 등 피부조직에서 대조군에 대한 IL 5과 IL 13 mRNA의 유전자 발현은 YJT를 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. Th1 세포에서 분비되는 IFN γ는 알레르기 반응을 일으키는 Th2 세포를 억제하고 IgE 생산을 증가시키는 B 세포 분화를 억제하는 것으로 알려진 사이토카인이다. 피부발진이 유발된 NC Nga 생쥐의 비장을 적출하여 비장세포를 배양한 후 배양상층액을 분리하여 IL 4와 IFN γ의 양을 측정한 실험에서 YJT를 투여한 실험군의 IL 4 수준은 대조군에 비하여 감소하기는 하였으나 유의성은 없었고 IFN γ 수준은 YJT투여군, YJT 투여군 모두 유의성 있게 증가하였다. 이 결과는 YJT가 NC Nga 생쥐의 알레르기 자가 면역 질환으로 Th2 세포에서 분비되는 IL 4, IL 5, IL 6, IL 13을 억제하며 Th1 세포에서 분비되는 IFN γ를 증가시켜 Th2 세포를 억제하는 것일 것으로 보여진다. ALN, DLN, PBMCs 및 등 피부조직에서 유세포형광분석을 한 결과, PBMCs, 등 피부조직의 총세포수는 YJT투여군, YJT투여군 모두 유의성 있게 감소하였고, ALN, DLN의 총세포수는 대조군에 비하여 YJT를 투여한 실험군에서 감소하였으나 유의성은 없었다. PBMCs에서 CD3e+, CD19+, CD4+, CD8+, CD3e+CD69+, CD11b+Gr 1+, CCR3+와 ALN, DLN에서 CD3e+CD69+와 등 피부조직에서 CD4+, CD11b+Gr 1+의 총 절대 세포수는 YJT투여군, YJT 투여군 모두 유의성 있게 감소하였고 ALN에서 CD4+, CD8+의 총 절대 세포수는 YJT투여군에서, ALN에서 B220+CD23+와 DLN에서 CD4+의 총 절대 세포수는 YJT투여군에서 유의성 있게 감소하였다. CD11b+Gr 1+는 spleen, lymph nodes에서 염증 피부 및 조직으로 이동하여 많이 존재하는데 비만세포, 호산구세포에서 발현되며 CCR3+는 호산구에서 다량 발현된다. 따라서 이는 YJT의 투여로 인해 알레르기 반응에 의한 피부 염증이 억제되어 T 세포가 염증부위로 이행되는 것이 억제되고 호산구세포, 호중구세포 비만세포의 침윤이 억제된 결과라고 생각되며 YJT의 투여에 의하여 Th1과 Th2 세포의 불균형으로 초래된 아토피 피부염 생쥐에서 Th2 세포에서 Th1세포로 shift될 수 있음을 나타내는 결과로 생각된다. 실험에 사용된 YJT가 생체에 미치는 부작용의 여부를 판단하기 위해 3주간 YJT를 처리한 후 혈청중 blood chemistry를 분석한 결과에서 YJT를 투여한 실험군과 정상군, 그리고 대조군과의 큰 차이가 없었는데 이것으로 보아 YJT가 생체에 미치는 부작용은 없어보인다. 실험 종료 후 귀 일부를 절단한 후 H E 염색을 하여 귀 조직을 분석한 실험에서 YJT를 투여한 실험군은 대조군에 비하여 epidermis와 dermis의 두께도 현저하게 줄었고, leukocytes의 침윤은 보이지 않아 부종이 거의 사라진 것을 알 수 있었으며, 등 피부조직을 분석한 결과에서는 대조군에 비하여 epidermis의 두께가 현저하게 줄었고, 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 비만세포의 침윤이 감소된 것을 알 수 있었다. 또한 비만세포의 침윤을 관찰하게 위하여 조직검사 후 toluidine blue 염색을 한 결과에서도 대조군에 비하여 YJT를 투여한 실험군에서 toluidine blue에 반응하는 비만세포가 현저하게 감소한 것을 알 수 있었다. RBL 2H3에서 IL 4와 IL 13 mRNA 단백질 발현을 억제시켰다. RBL 2H3에서 IL 4와 IL 13 단백질 생산을 억제시켰다. RBL 2H3에서 GATA 2 단백질 발현을 억제시켰다. RBL 2H3에서 NF AT2 단백질 발현을 억제시켰다. RBL 2H3에서 c Fos 단백질 발현을 억제시켰다. RBL 2H3에서 NF κB p65 단백질 발현을 억제시켰다. 혈청 중 IgE 수준을 유의성 있게 감소시켰다. IL 5, IL 13, histamine의 생산량을 유의성 있게 감소시켰고, IFN γ의 생산량은 유의성 있게 증가시켰다. 대조군에 비하여 혈액 중 WBC, eosinophils, neutrophils의 세포수를 감소시켰다. PBMCs, 등 피부조직에서 총세포수를 감소시켰다. PBMCs에서 CD3e+, CD19+, CD4+, CD8+, CD3e+ CD69+, CD11b+Gr 1+, CCR3+의 총세포수를 감소시켰다. ALN에서 CD4+, CD8+, CD3e+CD69+, B220+CD23+의 총세포수를 감소시켰다. DLN에서 CD4+, CD3e+CD69+의 총세포수를 감소시켰다. 등 피부조직에서 CD4+, CD11b+Gr 1+의 총세포수를 감소시켰다. 귀 조직과 등 피부조직에서 epidermis의 두께와 dermis 부분의 침윤된 염증면역세포 및 비만세포 등을 현저하게 감소시켰다.