혈청결핍 상태에서 크레아틴이 RGC-5세포의 생존에 미치는 영향 document_id A220623243409

혈청결핍 상태에서 세포의 에너지 전구물질로 작용하는 크레아틴이 RGC 5세포의 생존에 미치는 영향을 알아 보고자 하였다. 혈청이 포함되지 않은 배지에서 RGC 5세포를 5 mM의 크레아틴에 노출시킨 후 세포의 생존을 MTT assay로 측정하였으며, 미토콘드리아의 호흡활성도를 resazurin assay로 조사하였다. 세포고사의 정도를 알아보기 위해 acridine orange Hoechest 33342로 생체염색을 시행하였으며 annexin PI 이중염색을 이용한 유세포분석을 시행하였다. 크레아틴은 혈청결핍상태에서 RGC 5세포의 생존을 유의하게 증가시켰으며, 생체염색과 유세포분석에서 세포고사를 감소시켰 다. 이러한 효과는 미토콘드리아의 호흡활성의 증가와 동반되어 나타났다. 에너지 전구물질인 크레아틴은 혈청결핍상태에서 세포의 생존을 증가시켰으며 이는 크레아틴이 망막신경절세포의 보호할 가능 성이 있음을 보여 준다. 신경절세포에서는 신경신호의 전달에 필요한 높은 수준의 에너지를 미토콘드리아에서 공급하는데, 망막신경절세포의 미토콘드리아의 기능을 약화되면 세포고사를 유발하며 미토콘드리아의 에너지 생산을 촉진시키는 물질들이 녹내장 치료에 도움이 될 것이라고 알려져 있다. Guanidine 복합체인 크레아틴은 미토콘드리아와 세포질의 creatine kinase의 전구물질로 이용되는데 크레아틴을 투여하면 세포 내 크레아틴과 phosphocreatine을 증가시켜 creatine kinase phosphocreatine system의 기능을 개선하여 ATP 재합성을 촉진하게 된다. 또한 세포질의 크레아틴 증가와 함께 미토콘드리아의 creatine kinase는 세포고사의 초기 단계에서 나타나는 미토콘드라이아의 permeability transition을 억제하게 된다. Creatine kinase phosphocreatine system은 고도의 에너지를 요하는 근육이나 뇌 조직에서 생리적으로 중요한 역할을 담당한다. 이러한 조직의 세포에서 고에너지를 가진 phosphocreatine은 즉각적인 에너지의 공급뿐만 아니라, 세포의 마이토콘드리아나 해당과정에 기질을 제공하여 에너지를 많이 소모하는 부위에 에너지를 생산할 수 있도록 한다. 크레아틴은 동물실험에서 세포보호효과를 가지고 있으며 신경전달을 지속시키고 저산소증에 의한 손상을 줄이는 것으로 보고되어 있으며, 이러한 효과는 크레아틴과 ATP를 동시에 공급할 경우 가장 효과가 크게 나타나는 것으로 알려져 있다. 혈청이나 포도당의 결핍에 의해 대사성 손상이 유발되면 세포내 ATP가 감소되어 신경세포가 손상 받는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 혈청을 결핍시킨 경우 세포의 생존이 저하되었으며 세포고사를 나타내는 형태학적 손상도 관찰할 수 있었다. 이때 크레아틴을 첨가한 경우 RGC 5 세포의 손실과 형태학적 변화를 줄일 수 있는 것을 알 수 있었다. 비록 다양한 실험에서 크레아틴이 세포보호효과를 나타내는 것으로 알려져 있지만 크레아틴의 작용 기전은 아직 확실하게 밝혀져 있지 않은데 현재까지는 에너지 저장을 촉진하는 것과 미토콘드라이아에서 permeability transitionpore를 안정화시키는 것이 작용 기전으로 알려져 있다. 미토콘드리아에서 creatine kinase는 크레아틴과 ATP를 phosphocreatine과 ADP로 변환시켜 세포질에 에너지를 제공하는데 허혈 상태에서는 크레아틴이 creatine kinase에 의해 ATP로 변환되기 때문에 ATP보다 빠르게 phosphocreatine이 소모된다고 한다. 본 연구에서 크레아틴은 뇌 신경세포에서와 마찬가지로 망막신경절세포에서도 세포보호효과를 나타내며 미토콘드리아의 호흡활성을 증가시키는 것으로 보아 미토콘드라이에 에너지를 공급함으로써 permeability transition을 막아 세포고사를 저하시킬 가능성이 있음을 알 수 있다. 즉 세포고사를 유발할 수 있는 혈청결핍상태에서 크레아틴을 공급함으로써 phosphocreatine을 더 많이 만들어 에너지를 제공하여 세포 손실을 저하시킬 수 있을 것이다. 따라서 creatine phosphocreatine system은 RGC 5세포에서도 에너지 대사에 중요한 역할을 하며 이러한 세포보호효과는 이전의 보고와 마찬가지로 미토콘드리아의 호흡활성도 증가와 동반되어 나타났다. 본 연구의 단점은 미분화된 RGC 5세포를 사용하였으므로 망막신경절세포를 일차배양한 경우와 RGC 5세포를 분화시킨 경우와는 그 기전이나 효과가 다르게 나타날 수 있을 것이며 또한 RGC 5세포 자체가 장기간 보관할 경우 변성이 될 가능성도 있으므로 실험 결과를 해석하는 데 있어 이러한 한계점을 고려해야 할 것이다. 따라서 이러한 한계점들을 보완하기 위해 향후 일차배양한 망막신경절세포를 이용한 더 자세한 연구가 필요할 것이다. 결론적으로 본 연구에서 크레아틴은 혈청결핍상태의 RGC 5세포에서 세포보호효과를 나타내었으며 향후 신경세포의 손상에 대한 보호역할도 가능성이 있을 것으로 생각한다.