자간전증 영양막세포에서의 heme oxygenase-1, nitric oxide synthase 의 발현 분석 document_id A220623243525

본 연구는 자간전증 산모의 태반에서 heme oxygenase 1, inducible nitric oxide synthase 와 endothelial nitric oxide synthase 의 발현을 확인하여 HO 1이 자간전증에 미치는 영향을 규명해 보고자 한다. 2008년 10월부터 2009년 8월까지 강원대학교병원 산부인과를 방문하여 산전진찰을 받고 분만한 중증 자간전증 임신부 15명과 정상 혈압을 가진 임신부 15명에서 획득한 태반을 대상으로 하였다. 임신부가 쌍태아, 당뇨병, 혈관질환과 같은 내과적 질환이 진단된 경우는 제외하였으며 대조군은 실험군과 비교하여 주수와 나이를 보정하여 정하였다. 연구 대상군에서 분만 직후 태반을 절제한 후 1×1 cm 크기로 2개를 절단하여 포르말린 고정과 파라핀 블록을 만들어 보관하였고 나머지는 실시간 중합효소연쇄반응 실험을 하기 전까지 저온 냉동고에 보관하였다. 이후 조직이 모두 모인 상태에서 실험군과 대조군의 영양막 세포에서 HO 1, iNOS와 eNOS의 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 면역조직화학검사는 HO 1을 대상으로 실시하였다. 통계 분석은 SPSS ver 12.0 프로그램을 이용하였고 실험군과 대조군의두 개의 집단에서 나오는 연속변수데이터의 비교를 위해 Student t test를 적용하였다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 양군 간의 일반적 특징을 비교하여 보면 분만 당시 임신부의 나이는 양군에서 통계학적 유의성이 없었다. 분만 당시의 임신주수도 통계학적 유의성이 없었다. 출생 체중은 자간전증군에서 정상군보다 통계학적으로 유의하게 작았다. 실시간 중합효소연쇄반응에서는 자간전증 환자의 태반에서 HO-1의 mRNA 발현은 정상 임신에서의 태반보다 감소하였다. 하지만 자간전증 환자의태반에서 iNOS와 eNOS의 mRNA는 정상임신에서의 태반보다 증가하였다. 면역조직화학검사에서 자간전증의 세포영양막세포에서 HO 1의 발현은 관찰되지 않았다. 자간전증 환자의 영양막 세포에서 HO 1의 mRNA발현은 정상군보다 낮게 발현되었으며 iNOS, eNOS의 발현은 정상군보다 높게 발현되었다. 이러한 결과를 바탕으로 향후 임신초기 단계에서 HO 1의 연구가 진행된다면 향후 자간전증의 병태생리를 규명하는 데 도움이 될거라 생각된다. 임신 20주 이후에 발생하는 고혈압과 단백뇨를 특징으로 하는 자간전증은 전체 경산모 임신의 3 10%를 차지하는 질환이다. 자간전증은 모성사망률과 신생아 이환율의 주요 원인이기에 많은 연구자들은 자간전증의 원인과 치료를 위해 노력하지만 아직까지 단일화된 원인과 치료가 제시되고 있지는 않다. 지금까지 알려진 자전증의 원인은 4가지로 제시되고 있다. 가장 많은 연구자들이 주장하고 있는 원인은 초기 태반형성과정에서 세포영양막 세포의 불완전한 침습으로 인한 나선동맥재형성의 실패이다. 두 번째 원인은 태아, 모체, 부체와 태반 간에 면역학적 순응에 장애가 발생한 경우이다. Hayashi 등에 의하면 정상 임신에서는 helper T1 cell과 T2 cell이 균형 있게 존재하여 배아의 착상을 도와야 하는데 자간전증 산모에 있어서는 helper T1 cell이 부족하다는 연구결과를 보고하면서 면역학적 장애를 자간전증의 원인으로 제시하였다. 세 번째 원인은 정상 임신과정에서 발생하는 염증반응이나 심혈관계의 반응에 모체가 적응하지 못할 때 발생한다. 마지막으로 유전학적 소인이 있는 경우에 발생한다. 나선동맥은 자궁근층에 있는 요골동맥으로부터 기원하는 동맥으로 자궁내막에만 존재한다. 이 혈관은 호르몬과 혈관수축물질에 의해서 조절되기에 정상 생리기간에는 탈락되어서 생리혈과 같이 몸 밖으로 배출된다. 하지만 임신이 되면 기저 탈락막 아래의 나선동맥은 호르몬과 혈관수축물질에 반응하지 않는 혈관으로 변화되어서 지속적이고 안정적으로 태반에 혈액을 공급한다. 이러한 나선동맥의 재형성에는 세포영양막세포가 중요한 역할을 담당한다. 정상적인 세포영양막세포는 수정 6일째에 발생하는 trophectoderm으로부터 기원하고 태반형성에 중요한 두 가지 역할을 수행한다. 첫 번째는 태반의 융모를 형성하여 분지하면서 태반의 크기를 키우고 융모를 1단계, 2단계, 3단계의 융모로 성숙시킨다. 이러한 과정 중에 융모내부의 혈관이 형성되면서 태반과 태아가 순환되는 시스템이 완성된다. 두 번째는 자궁의 탈락막을 침습하여 자궁내막 기질세포를 용해하고 나선동맥재형성에 관여한다. 정상적인 세포영양막세포의 증식, 분화에 장애가 발생할 때는 자간전증과 같은 임신 합병증이 발생한다. 세포영양막세포의 증식과 분화에는 많은 인자들이 관여하고 산화질소도 그중 하나이다. 산화질소는 강력한 혈관확장물질로 임신초기 태반에도 중요한 영향을 끼친다. 산화질소 형성을 억제하면 세포영양막세포의 증식과 분화에 장애가 발생하고 나선동맥재형성이 발생하지 않아 자간전증이 발생한다는 연구가 있다. Myatt 등에 의하면 임신초기에 산화질소 생성을 억제하였더니 tromboxane과 endothelin이 증가하여 평균 혈압이 상승하고, 심박동수가 감소하였으며 임신성 고혈압이 유발되었음이 보고되었다. 2004년 Wang 등의 연구에서도 유사한 결과를 보고하였다. 고혈압이 발병하기 전에는 자간전증 산모에 있어서는 NOS의 발현이 감소하여 산화질소가 감소함을 확인하였고 이후 보상기전에 의하여 NOS와 산화질소가 증가하였음을 보고하였다. 본 연구에서도 기존의 연구와 비슷하게 iNOS, eNOS의 mRNA가 정상군에 비해서 자간전증군의 태반에서 높게 발현되었다. 하지만 최근에는 자간전증에서 발견되는 NOS의 증가와 산화질소의 증가가 보상기전만으로는 설명할 수 없다는 연구결과도 발표되고 있다. Lyall은 자간전증의 세포영양막세포에 발현되는 NOS는 주로 세포조직에 항시 존재하는 eNOS로 염증반응이나 저산소증이 있는 경우 유도되는 iNOS는 거의 없다고 보고하였다. 또 다른 연구에서도 자간전증과 자궁내 태아발육부전을 앓고 있는 산모와 정상산모의 비교 실험에서 세포영양막세포에 있는 NOS의 발현에는 차이가 없다고 보고하였다. 이러한 보고는 본 연구의 결과와는 상반된 결과이다. 결과에 차이가 나는 원인을 추정해 보면 먼저 실험 방법의 차이에 기인한다고 여겨진다. Lyall의 실험은 태반조직보다는 태반아래 자궁내막 조직을 대상으로 한 연구이고 본 연구는 태반 자체를 이용한 연구이기에 다른 연구 결과가 나왔을 수 있다. 이를 검증하기 위해서는 다음 실험에서 Lyall과 동일한 방법으로 재현성 실험을 실시하여 자궁에 존재하는 세포영양막세포와 융모에 존재하는 세포영양막세포의 차이를 확인해볼 필요가 있다. Heme oxygenase는 1968년 Tenhunen 등에 의해서 발견된 분해효소로 대사산물인 일산화탄소, 철 및 빌리버딘은 항염증 및 항 산화기능을 가지고 있다. HO는 분해효소로 대사산물을 생성하기도 하지만 그 자체적으로도 대뇌 중추계에서 신경물질, 혈관확장작용, 혈소판감소와 항 염증 작용을 수행한다. HO는 크게 3가지 아형이 존재한다. HO 1형은 주로 포유류의 조직에 많고 평상시에는 비장이나 간과 같은 적혈구 생성이 되는 곳에 주로 분포하며 저산소증이나 염증반응에 대응해서 나타나는 유도형 아형이다. HO 2형은 신체에 균등하게 분포되어 있으며 기본적인 헴 대사를 유지하는 역할을 수행하고 대체로 일정하게 몸 안에 존재한다. HO 3형에 대해선 알려진 바가 없다. HO는 태반에서도 중요한 역할을 수행한다. Yoshiki 등에 따르면 HO 1, HO 2의 단백질 및 mRNA는 정상적인 인간의 태반에서 존재한다. 면역조직화학염색검사에서 HO 1 단백질은 인간 융모성 영양막세포에서 발현되고 HO 2 단백질은 태반 융모의 혈관에 존재하는 평활근세포와 내피세포에서 발현된다. HO는 임신 기간 동안 태반에서 발현되지만 임신 시기에 따라서 각기 다른 아형이 발현된다. 임신초기에는 HO 2가 합포영양막세포에서 발현되고 임신후기에는 감소하는 데 반해 내피세포에 존재하는 HO 2는 임신후기로 갈수록 증가한다. HO 1은 태반아래 조직에서 세포영양막세포에서 높게 발현된다. HO 1 mRNA는 정상적인 생쥐의 태반의 영양막세포에서 발현되지만 임신 주수가 진행이 될수록 감소한다. 태반에서 HO 발현에 장애가 있을 때 임신 합병증을 유발한다. 하지만 어떤 아형이 임신성적에 관여하는지 임신 어느 시기에 임신 합병증을 유발하는지에 대한 연구는 많이 부족하다. Ihara 등에 의하면 생쥐의 자궁동맥 결찰로 발생하는 급성 저산소증이 있는 경우에는 HO 1의 감소가 더욱 심하여서 HO 1이 저산소증에 관여한다고 주장하였다. 본 연구에서도 이들과 비슷한 결과를 얻을 수 있었다. 자간전증의 태반에서는 HO 1의 mRNA의 발현이 정상군에 비해서 낮았고 자간전증의 경우에는 정상군에 비해서 세포영양막세포에서 HO 1이 발현되지 않았다. 하지만 이러한 결과가 초기 나선동맥의 재형성과정의 원인으로 나타나는지 결과로 나타나는지는 분만 후 태반을 이용한 본 실험의 한계로 정확히 규명할 수는 없었다. 이와는 상반되게 HO 2가 임신 합병증에 더 영향이 있다고 보는 연구 결과도 있다. Barber 등의 보고에서는 자간전증 및 자궁 내 태아성장장애와 같은 자궁태반혈류장애가 있는 자궁조직에서 채취한 혈관내피세포에서 HO 2의 발현이 감소하였으며 허혈성 태반의 융모에서도 H 2의 활성도가 감소하였다. 또한 Western blot 검사에서 HO 1이 감소하였으며 특히 혈관내피세포의 HO 2의 발현 감소는 태반으로 들어가는 혈류량의 감소와 연관이 있다고 주장하였다. Zenclussen 등에 의하면 자연유산이 발생한 조직을 대상으로 한 비교연구에서 세포영양막세포, 혈관내피세포, 합포세포막세포, 탈락막에서도 정상에 비해서 HO 2의 감소함을 보고하였다. Lash 등에 의하면 경증의 자간전증 환자의 태반과 정상군 간에는 HO 1 단백질의 차이를 보이지 않았는데 본 연구의 결과는 Lash의 결과와는 상반되는 결과인데 이는 자간전증의 대상군의 차이 때문일 것으로 보인다. 즉 Lash는 경증 자간전증을 실험군으로 하였고 본 연구에서는 중증 자간전증을 대상으로 하였기에 동일한 결과가 나오지는 않았을 것이다. 결과적으로 본 연구에서는 자간전증의 환자의 태반에서 iNOS, eNOS의 mRNA발현은 정상에 비해서 증가하였고 HO 1의 mRNA발현은 정상에 비해서 감소하였다. 또 자간전증의 세포영양막 세포에서는 HO 1의 발현이 감소하였다. 이러한 결과는 자간전증의 병태생리에는 iNOS, eNOS뿐만 아니라 HO 1도 관여함을 알려주는 증거이지만 이 결과가 자간전증의 원인인지 결과인지는 본 실험에서는 확인할 수 없었기에 향후 동물 실험을 통해서 초기임신 시 HO 1의 역할을 규명한다면 자간전증의 병태 생리를 이해하는 데 도움이 될 거라 생각된다.