의료기기 이식시험 시 생체흡수성 원재료의 분해 특성 평가, 전신독성 검토 및 조직학적 분석 방법론 doc_id CNTS-00118871651_5

ISO 10993-6 ‘의료기기의 생물학적 평가-제6부: 이식시험’에는 in vivo 에서의 실시간 분해는 조직반응에서 완전한 분해나 안정화 단계에 도달하기까지 더 긴 시간이 필요할 수 있다. 그러므로 이식 후 늦게 나타나는 현상을 모의로 나타내기 위해서는, in vitro에서 미리 분해된 물질(예를 들면 50% 중량 감소 또는 50% 기계적 강도 감소)을 이식하는 방법을 고려할 수 있다. 그러나 이러한 실험적 연구(exploratory study)는 원자재의 실시간적인 in vivo 분해특성 시험을 대신할 수는 없다고 기재되어 있다. 이식 시험 시, 실현 가능성을 확인하는 예비검토시험으로 가속 분해한 원재료를 이용해 검토할 수 있으나 최종적인 평가는 별도 풀타임 시험을 실시할 필요가 있다. 이식시험 시, 분해과정과 조직재생의 균형을 확인하면서 이식 초기 (원재료 분해가 시작되는 시기) 및 이식 중기(원재료 분해가 활발한 시기), 이식 후기(거의 흡수된 시기)의 평가가 필요하다. 단, 이식 후기에 잔존분해물 등이 선유성(線維性) 조직의 피포에 한 번 덮이면 그 이상 쉽게 분해되지 않는 경우가 있다. 이러한 케이스는 동물의 수명 전주기 동안에도 평가가 불가능 할 수 있다. 생체흡수성 원재료를 이식할 때, 생체 내에서 소실되기 때문에 이식 부위를 특정할 수 있는 연구가 필요하다. ① 이식 시에 사진을 촬영하는 등 이식 위치를 특정한 후, 그 위치에 시험 원재료가 없으면 흡수되었다고 본다. ② 음성 대조 원재료 및 국소부위에 영향이 없는 것으로 알려진 물질을 동시에 이식해 그 부근을 관찰한다. ③ 엑스레이 촬영 등을 경시적으로 실시해 이식 부위를 특정하는 등의 방법이 있다. 이식시험으로 전신독성을 함께 평가하는 시험의 경우, 전신독성을 평가하기 때문에 동물 한 개체당 이식하는 양이 핵심이다. 이식 시험은 국소반응을 평가하기 때문에 총량보다 이식 수를 늘려 관찰부위에 따른 편차를 줄이는 것이 중요한데 전신독성은 체중당 노출량과 관련이 있으므로 총 이식량이 사람의 임상 사용량보다 적을 때에는 올바르게 평가할 수 없게 된다. 이러한 경우에는 사람의 노출량보다 적지 않은 범위에서 가능한 한 안전계수를 높여 시험한다. 또한 충분한 안전계수를 설정할 수 없을 때에는 생체 내 동태를 모의 제조한 추출액을 동물에 투여함으로써 전신독성을 평가한다. ISO 10993-11에 따라 체중 변화, 일반상태 관찰 외에 혈액·뇨 검사, 전신 장기의 해부병리검사, 장기 중량 측정 및 전신 장기의 병리조직학적 검사를 실시한다. 이와 함께 원재료가 분해되었을 때에 방출되는 분해산물을 확인하고 그것이 어떻게 체내에 분포해 대사를 받아 배설되는지 평가한다. 방출되는 물질이 생체를 구성하는 물질인 경우에도 급격하게 분해되면 혈중 농도 값이 일시적으로 높아질 수 있다. 따라서 체내 동태를 평가할 필요가 있다. 또한 기술적으로 이식시험과 동시에 전신독성을 평가하기 어려울 때에는 추출액을 반복 투여해 전신 상태를 평가하게 되는데, 예를 들어 추출물이 마그네슘 등 체내 정상적 영양소인 미네랄 성분이라도 정맥 내에 투여하여 혈중 농도가 급격하게 상승하면 독성 반응 및 사망의 원인이 되므로 투여량 및 투여 경로에 주의해야 한다. 마그네슘 합금은 체내의 분해생성물의 동태를 파악하는 것이 중요하다. 분해과정 평가에는 동물 및 세포 등을 이용한 평가가 유용하며 원재료를 그대로 동물에 이식하는 시험 및 추출액을 동물 등에 노출시키는 시험이 있다. 이식조직 및 육안으로 이상을 확인한 경우, 이식 주위 림프절을 즉시 고정액에 담근다. 일반적으로는 10% 중성 완충 포르말린 액으로 고정하고, 고정 완료 후에 분리하여 파라핀 포매, 박절을 진행한다. 헤마톡실린에오진 염색(H&E, Hematoxylin and Eosin)을 하여 광학 현미경으로 관찰한다. 그 외의 다른 고정법(固定法) , 포매법(包埋法) 및 염색방법을 사용할 수도 있다. 관찰 시에 가장 중요한 부위는 이식 시험 원재료와 생체조직과의 계면이므로 계면을 잘 보존할 수 있는 방법을 최우선으로 고려한다. 잔존 시험 원재료가 딱딱하면 얇게 절단하는 것이 어려우므로 조직에서 제거할 수밖에 없으나 생(生)상태에서는 주위 조직을 파괴할 우려가 있기 때문에 고정(탈회) 후에 뽑는다. 이러한 방법을 적용할 수 없을 때에는 이식 부위 전체를 수지 포매해 연마 표본을 제작하는 것을 검토한다. 계면의 세포활성화와 세포의 총 발현 양 등을 검출할 수 있는 면역조직 화학적 염색을 위해서는 조직의 손상을 막기 위해서 석회질제거 후 냉동/젤라틴포매하여 진행한다. 조직 염색법으로는 일반적으로 알리자린 레드-S(Alizarin red-s)염색 및 톨루이딘블루(Toluidine blue)염색이 이용된다. 골내 이식은 재래골(在來骨) 또는 신생골(新生骨)과 시험 원재료의 계면이 중요한 관찰 포인트인데 수지 포매·연마 표본은 계면 보존이 용이하다. 또한 Villanueva염색 및 VilIanueva-Goldner 염색을 한 표본은 석회화골과 유골 판별이 용이하다. 현미경으로 관찰하여 이식 주위에 확인된 염증성(炎症性) 세포의 종류 및 출현 정도, 기타 확인된 이상 소견을 기록한다. 아래에 제시된 관찰 포인트 외에도 중요한 점이 있으면 추가한다. 절편(切片)으로 만들 수 있는 경우에는 이식시험 원재료의 잔존율을 조직 형태 계측을 통해 해석함으로써 경시변화를 정량적으로 평가할 수 있다.