갱년기 및 골다공증 관련 생체 지표 측정 방법과 증상 및 안전성 평가 지표에 관한 연구 방법론 doc_id CNTS-00118871964_2

골다공증은 골량이 감소하고 골의 미세구조적인 변화가 나타나 작은 충격에도 쉽게 골절이 되는 대사성 질환이다. 폐경기의 에스트로겐 결핍은골 손실을 가속화시킨다고 알려져 있으며, 에스트로겐 요법은 골다공증성 골절의 위험을 감소시킨다고 한다. 에스트로겐은 골 흡수(bone resorption)를 억제한다고 알려져 있는데, 골수에서 파골세포 전구체의 양을 증가시켜 골 흡수를 증가시키는 염증성 사이토카인, 즉 IL-1, IL-6, TNF-α, GM-GSF(granulocyte macrophage colony-stimulating factor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), 프로스타글란틴-E2 (prostaglandin-E2)를 감소시킨다. 산화질소의 경우 세포, 동물에서 모두 측정가능하며, 시중에 상용화된 분석 키트를 이용하여 측정가능하다. 산화질소의 대사산물인 혈장 nitrite/nitrate를 측정하게 되며, 비색법으로 540nm에서 측정한다. eNOS의 경우 동물실험시 혈관 등을 이용하여 RNA를 추출하고, cDNA 합성 후 real time PCR로 정량한다. Endothelin-1는 세포, 동물 및 인체 혈액 및 소변을 이용하여 측정할 수 있으며, 상용화된 ELISA를 이용하여 450nm에서 측정한다. 혈장 지단백질 중 HDL은 dextransulfate-MgCl2 침전법으로 분리하고, 혈장 총 콜레스테롤과 HDL 콜레스테롤 농도는 총 콜레스테롤 측정용 시액의 효소 시약과 반응시킨 후 500nm에서 흡광도를 측정하여 각각의 표준곡선을 기준으로 농도를 계산한다. LDL 콜레스테롤 농도는 Friedewald 공식으로 계산한다. AKT나 ERK는 세포 표면의 수용체로부터 받은 신호를 세포 핵 속 DNA로 전달하는 역할을 하는 단백질들이다. 이들 단백질들이 에스트로겐 수용체 signaling에서도 관여하므로 단백질 발현 측정을 통해서 에스트로겐 수용체 활성화를 확인할 수 있다. 시험동물의 자궁조직에서 Western blotting 방법으로 측정할 수 있다. 시험물질의 ERα나 ERβ에 대한 결합친화력(binding affinity)을 측정하여 시험물질이 estrogen과 유사한 활성을 갖는지 간접적으로 확인하는 방법이다. 전통적인 에스트로겐 수용체 결합 실험(ER binding assay)은 방사능 리간드(ligand)의 교체(displacement) 능력을 통해서 결합력을 측정하고 ‘fluorescence polarization(FP) method’와 같은 방법은 고친화력 형광 리간드 교체 능력을 통해서 결합력을 측정한다. NTx 및 CTx 측정은 상용화된 키트를 사용할 수 있으며, 제조사에 따라 프로토콜이 상이 할 수는 있으나, 대표적으로는 항원을 96-well에 투입하고 sealing 하여 인큐베이션하여 CTx가 well에 흡착할 수 있도록 한다. 워싱과정을 거쳐 표준품과 대조군, 시험군 샘플을 투입하고, primary antibody과 secondary antibody를 순차적으로 반응시킨다. 최종 450nm에서 흡광도 값을 확인한다. 혈장 오스테오칼신은 분석 시료에 따라 상용화된 키트를 이용하여 전기화학적발광면역 분석법(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA) 혹은 ELISA 방법으로 분석할 수 있다. 분석방법은 각 제조회사의 매뉴얼을 따르도록 한다. 혈중 알칼리 인산분해효소는 무색인 ρ-nitrophenyl phosphate(PNPP)가 알칼리 상황시 ρ-nitrophenol(황색)으로 변화되어 405nm에서 비색법으로 측정하는 원리로 분석한다. 동물의 질벽을 면봉으로 문질러 질 상피 세포를 슬라이드 글라스(slide glass)에 도포하고 염색하여 백혈구(leukocyte cells), 유핵세포(nucleated cells), 각화 상피세포(cornified cells)의 수를 측정하여, 각화 상피세포의 비율을 구한다. 질 점막 세포 중의 각화 상피세포의 비율이 높다는 것은 질 각질화 수준이 감소하였고 질 점막이 유연하다는 것을 의미한다. 질 상피세포는 세포들의 모양에 따라 부기세포(parabasal cell), 중간세포(intermediate cell), 표면세포(superficial cell)로 이루어져 있는데, 질 성숙 지수는 각 세포의 백분율을 통해 계산되는 값이다. 질 성숙 지수가 낮을 경우 질이 위축되어 있을 가능성이 있으며, 이 때 보통 부기세포와 중간세포의 분율이 높다. 여러 연구들에서 연령이 증가될수록 폐경기간이 길수록 성숙지수가 낮은 것으로 보고되고 있다. 대표적인 갱년기 증상을 점수화하여 갱년기 장애의 정도 및 특징을 파악하는 설문도구로서 안면홍조, 감각이상(손발 저림), 불면증, 신경과민, 우울증, 현기증, 피로감, 관절통이나 근육통, 두통, 가슴두근거림 그리고 의주감(피부에 개미가 기는 느낌, 근질근질함)의 11가지 갱년기 증상에 대해 평가한다. 각 증상에 대해서 0점(증상없음)에서 3점(몹시 괴롭다)의 4점 척도로 점수화하고, 안면홍조는 4점의 가중치, 감각이상(손발 저림), 불면증, 신경과민은 2점의 가중치, 나머지는 1점의 가중치를 두어 총 51점으로 이루어진다. 단, 질 건조감 성욕 감소 등의 갱년기 증상을 묻는 문항이 빠져 있다는 제한점이 있으며, 이에 따라 질 건조감과 관련한 문항을 추가 하여 사용하는 경우도 있다. 갱년기 여성의 삶의 질을 평가하는 도구로 심리적 증상, 신체 증상, 비뇨 생식기 증상의 3개 영역, 11개 문항으로 구성되며 각 문항에 대해서 0점 (없음)에서 4점(매우 심함)의 점수로 평가한다. 갱년기 증상 개선 효과를 확인하기 위한 연구에서는 다른 기능성 연구와 마찬가지로 안전성 평가를 위하여 일반적인 임상병리검사(혈액, 소변)를 실시하고 활력징후(체온, 맥박, 혈압 등), 알레르기 반응, 체중 변화 등의 이상반응을 확인하며, 또한 갱년기 기능성 원료의 작용 기전으로 인하여 아래와 같은 안전성 평가를 추가로 실시하는 것을 권장하고 있다. 안전성과 관련하여 내분비 기능에 미치는 영향을 측정한 연구들에서는 유방 X선 검사를 통한 유방밀도(mammographic density), 질 초음파 검사를 통한 자궁내막의 두께, 혈액학적 검사를 통한 에스트라디올(estradiol), 난포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH) 등이 변화가 없음을 확인할 필요가 있다.