CRISPR/Cas9을 포함한 다양한 유전자 편집 및 형질전환 기술의 메커니즘과 특징 및 응용 방식 doc_id CNTS-00120007405_2

3세대 유전자가위인 CRISPR/Cas9는 구현의 메커니즘 측면에서 1세대 및 2세대와 확연한 차별성을 갖는다. CRISPR은 1987년 일본의 요구르트 회사에서 산업적으로 이용되는 유산균에 감염되는 파지(phage)를 연구하다가, 원핵생물체에 짧은 반복염기서열이 유사하게 존재하는 것을 확인함으로써 발견되었다. 이후 이 염기서열에 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)이라는 이름이 붙여졌고, 2007년 CRISPR은 박테리아가 외부 침입에 대응하는 면역체계의 일부로 확인되었다. 박테리아는 인간과 같이 외부에서 유전자가 침입해 오면 이를 분해하고 파괴하는 면역체계를 갖고 있다. 박테리아는 파괴한 외부 유전자의 일부분을 잘라 유전체에 저장해 두었다가, 다시 침입해 올 경우 발현시켜 즉각 대응하는데 이것이 박테리아의 면역체계인 CRISPR 시스템이다. 유전자편집은 발전을 거쳐 온 것으로 몇 가지 유형으로 구별되지만 현재는 대체로 ‘크리스퍼’ 유전자 가위 기술이 이용되는 것이 보통이다. ’카스9’ 유전자 가위 절단효소는 가이드 RNA를 이용해 원하는 목표 유전자를 찾아 편집한다. 외부 유전자가 인위적으로 들어오지 않는다는 점에서 전통육종과 유사하다. 다만 육종은 자연교배로 새로운 유전자 재조합이 이뤄지지만 유전자 편집 작물은 인위적인 유전자의 재조합이 발생한다는 점에서 차이가 있다. 시간과 비용이 많이 들고, 예측이 어려운 전통적 육종과 유전자변형(GM) 기술과 비교해 경제적이고 빠르다. 또한 유전자편집 기술은 DNA(deoxyribonucleic acid)의 특정 배열 중 문제되는 부분을 제거하거나 다른 정상적인 조합의 유전자를 삽입하는 것이다. Doudna교수의 CRISPR-Cas9 기술개발 전에도 유전자 편집기술이 있었지만, 비용과 시간적인 측면에서 일반적인 활용이 어려워 세계적으로 소수의 연구소에서만 운용이 가 능했다. 그러나 CRISPR-Cas9 기술은 기존의 유전자편집 기술에 비해 정확도가 높으면서도 짧은 시간에 편집을 위한 효소를 만들 수 있어서 기존 기술에 비해 획기적인 개선이 이루어진 것으로 평가받고 있다. 식물의 게놈 내 목표로 하는 특정 DNA 단편만 인식하여 편집할 수 있는 정확도를 높이는 site-directed nuclease(SDN)기술을 접목하기 위한 연구는 활발하게 진행되고 있다. 대체로 SDN기술은 목표로 하는 DNA 단편만 정확하게 인식하는 분자와 이 부위를 절단하는 핵산가수분해효소(nuclease)로 구성되어 있다. SDN기술이 작물에 응용되기 시작하면서 European Food Safety Authority (EFSA)의GMO패널그룹에서는 “게놈의 목표로 하는 특정 DNA단편의 이중나선을 자르고 그 위치에 돌연변이를 유발하거나 특정 카셋트를 삽입하는 모든 기술들”을 총칭하여 SDNs기술에 포함하기로 하였으며 현재까지 개발된 zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)기술 뿐만 아니라 향후 개발될 것으로 전망되는 모든 관련된 새로운 기술들을 포함하도록 하였다. Cisgenesis와 intragenesis의 기본 원리는 유전자변형 생물체를 생산하는 transgenesis와 동일하다. 다만 transgenesis에 이용하는 유전자는 동식물, 미생물 등 그 유래에 제한을 두지 않는 것에 반하여 cis(intra) genesis에서는 대상 생물종 혹은 교배가 가능한 근연종 유래의 유전자를 이용한다. Cisgenesis와 intragenesis는 도입유전자의 구조에 차이가 있다. Cisgenesis에 서는 내재 유전자 세트를 가공하지 않고 본래 가지고 있던 promoter, 조절부위, intron과 exon을 그대로 형질전환에 이용한다. 반면에 intragenesis에서는 서로 이질적인 유전자와 promoter 등을 결합시키거나 intron이 제거된 mature cDNA 유전자로 만들어 이용한다. 내재서열을 이용한 RNAi 기술도 intragenesis로 분류된다. Cisgenesis에서는 도입유전자가 본래의 조절 기작에 따라 발현되므로 발현 강도 정도에만 변화를 일으키지만, intragenesis에서는 유전자 발현 정도, 발현 패턴의 조절도 가능하다. RdDM은 타겟 유전자와 homology가 있는 double strand RNA(dsRNA)를 이용하여 유전자의 특정 염기에 메틸기를 부가함으로써 발현을 조절하는 기술이다. 세포 내에 넣어준 dsRNA를 식물의 방어 기작이 인식하면 DICER 단백질이 dsRNA를 분해하여 24 nt의 siRNA로 만든다. 이렇게 만들어진 siRNA는 식물 방어 기작을 자극하여 DNA methylation 과정을 일으키고, 타겟 사이트에 메틸화를 일으키게 된다. 이와 같은 방법으로 얻은 형질의 변화는 유전자 염기서열의 변화가 없는 epigenetic modification이다. 다만 메틸화한 DNA 염기의 물리적 성질 변화에 따른 염색체 구조 변화와 특정 유전자 발현의 변화가 몇 세대에 걸쳐 유지된다. Cisgenesis와 intragenesis로 형질전환체를 만들 때 고려해야할 또 다른 요소는 형질전환 과정 중 식물체로 이전되는 agrobacterium의 T-DNA와 기타 외래 DNA단편이다. 식물에도 Plant transfer DNA라는 T-DNA와 유사한 성질을 가진 DNA시퀀스가 존재하며, 이를 형질전환에 활용하면 T-DNA단편 삽입의 문제를 해결할 수 있다. 이외에 vector backbone, 선발 마커 등 형질전환체에서 발견할 수 있는 비식물 유래 DNA 단편을 형질전환 식물 유전체에서 배제하기 위해서 무선발 형질전환, cotransformation, recombination site를 이용한 형질전환체 선발 후 마커 유전자 제거 등의 전략이 사용되기도 한다. Cisgenesis나 intragenesis 기술을 활용하여 개발한 작물의 예로 역병 저항성 감자(cisgenic)가 포장시험 중이며, cisgenic 곰팡이병 저항성 사과, intragenic 딸기 등도 보고된 바 있다. ODM에서는 유전자 편집과 달리 SDN을 이용하지 않고 20-100nt 정도의 oligonucleotide를 이용해 변이를 유도한다. Oligonucleotide는 바꿀 염기를 제외하고는 타겟 시퀀스와 동일하게 합성한다. 이를 대상 생물체의 세포에 넣으면 타겟 부위에 결합하며, 이때 발생하는 mismatch를 세포의 DNA 수선체가 제거한다. 이 과정에서 도입된 oligonucleotide가 template로 사용될 경우 1개 혹은 여러 염기의 치환, short deletion 또는 insertion과 기존 변이의 reversal 등 의도한 변이가 발생하며 template로 이용된 oligonucleotide는 분해된다. ODM에서는 DNA 절단 없이 oligonucleotide를 이용하여 게놈상의 원하는 위치에 자연적인 allelic 변이를 유도하므로 변이체 획득 효율이 최대 0.05%로 낮은 편이다. 또한 DNA나 RNA 형태의 oligonucleotide를 식물 세포의 원형질체에 넣어야 하므로 원형질체 배양과 식물체 재분화 체계가 확립된 대상으로 활용범위가 제한된다.